石灰氮对堆肥化过程中牛源致病性大肠杆菌抑制及对堆肥化效果影响

论文摘要

试验通过现场直接从健康奶牛直肠采集鲜粪样、在实验室进行大肠杆菌的分离培养、动物致病性试验、生化特征试验、血清型分型、多重PCR技术等系统研究了牛源致病性大肠杆菌的分布及特征,并探讨了草药对不同血清型牛源致病性大肠杆菌的抑菌效果。同时,将石灰氮作为抑菌剂添加牛粪堆肥中,研究了其对不同血清型牛源致病性大肠杆菌的抑菌效果。项目研究将对大肠杆菌传播、感染提供有力防控措施,对我国奶牛业的健康发展和防治致病菌病爆发具有重要意义。并且,石灰氮在堆肥中的应用研究对扩展其应用领域提出了一条新的可行性路线。研究内容主要分三部分:第一部分牛源致病性大肠杆菌分离鉴定、毒力因子检测以及药物试验试验从内蒙古包头市规模化奶牛场206头泌乳奶牛和呼伦贝尔市4个牧业旗个体户奶牛场212头泌乳奶牛直肠采集鲜粪样,进行了大肠杆菌分离培养、生化特征试验、血清型分型、动物致病性试验和多重PCR技术检测毒力因子。在此基础上,选择具有抗菌、低毒、耐药性发生率低的草药进行了体外抑菌试验,检测其防治致病性大肠杆菌能力。结果表明:⑴包头市采集粪样中大肠杆菌检出率为83.50%,其中致病性大肠杆菌占40.12%。其优势血清型为O78、O2和O8,分别占定型菌株38.89%、33.33%和14.81%。呼伦贝尔市采集粪样中大肠杆菌检出率为47.64%,其优势血清型为O149、O131、O2和O96,分别占定型菌株9.30%、8.14%、6.98%和6.98%。⑵多重PCR技术检测结果表明,呼伦贝尔市采集粪样中33.66%粪样和27.72%菌株分别携带毒力因子。其中,eaeA基因检出率最高,其携带率分别为粪样的26.73%和菌株的22.11%。并且,非典型肠致病性大肠杆菌（aEPEC）分布最广,其携带率为粪样的21.78%和菌株的18.15%。⑶草药对呼伦贝尔市试验菌抑菌能力为苍术>瓜蒌>黄芩>黄连>蒲公英。对包头市试验菌抑菌能力为黄芩>黄连>瓜蒌>苍术>蒲公英。证实不同药物体外抑菌效果存在差异,同一种药物对不同血清型牛源致病性大肠杆菌抑菌效果也有所不同。第二部分鲜牛粪堆肥中添加石灰氮对不同血清型牛源致病性大肠杆菌的抑制试验采用实验室堆肥技术研究了不同比例石灰氮（0%、2%、3%和4%）在不同堆肥温度条件下（20℃、30℃、37℃、50℃和60℃）,对鲜牛粪堆肥中不同血清型牛源致病性大肠杆菌（O2、O8、O78和O86）的抑菌效果,并探讨了石灰氮对鲜牛粪堆肥中内源性大肠杆菌、嗜温菌和嗜热菌的抑菌作用。同时,通过以无菌水和菌液调整灭菌牛粪水分含量（调节至45%、65%和85%）后,添加不同比例石灰氮（0%、2%、3%和4%）进行堆肥,研究了牛粪堆肥水分含量对石灰氮抑菌效果影响。另外,采用不同浓度石灰氮培养基(0.01–10.00 mg·mL–1)上接种不同血清型牛源致病性大肠杆菌进行培养和不同血清型牛源致病性大肠杆菌菌液中添加不同浓度石灰氮(1.00–10.00 mg·mL–1)进行培养,分析了石灰氮对不同血清型牛源致病性大肠杆菌生长繁殖的直接影响。结果表明:⑴鲜牛粪堆肥中添加3%和4%石灰氮,对O2和O8血清型牛源致病性大肠杆菌具有良好的抑菌作用。无论在高温（50℃和60℃）还是在中低温（20℃、30℃和37℃）条件下,均能在较短的时间内（3d）可彻底杀灭O2和O8血清型致病性大肠杆菌。添加2%石灰氮,在高温条件下抑菌效果好于中低温条件。并且,石灰氮对O2和O8血清型致病性大肠杆菌的抑菌效果存在显著差异,对内源性大肠杆菌的抑菌效果也呈现类似的规律。⑵鲜牛粪堆肥中添加3%石灰氮,在30℃和50℃条件下对嗜温菌和嗜热菌生长有一定影响,但嗜温菌和嗜热菌基本上保持正常的生长规律。⑶鲜牛粪堆肥中添加石灰氮对牛源致病性大肠杆菌的抑菌作用与堆肥水分含量有密切关系。堆肥水分含量85%时最有利发挥石灰氮抑菌作用,其次为65%,最弱为45%,表明堆肥水分含量高有利于发挥石灰氮抑菌作用。⑷石灰氮对不同血清型牛源致病性大肠杆菌的生长具有抑制作用。随石灰氮浓度的增加对致病性大肠杆菌的抑菌效果也明显增强。而且,石灰氮对牛源致病性大肠杆菌的抑菌效果受温度影响,堆肥高温（50℃和60℃）有利发挥其抑菌作用。另外,石灰氮对不同血清型牛源致病性大肠杆菌生长的抑菌效果存在差异。第三部分石灰氮对鲜牛粪堆肥化效果影响试验在堆肥原料中分别接种不同血清型牛源致病性大肠杆菌（O2、O78和O86）菌液,设添加0%、2%和3%石灰氮组,进行63d堆肥。在堆肥期内定期测定物理、化学和生物学指标。结果表明:⑴鲜牛粪堆肥中添加2%石灰氮,堆肥温度在29–31d达到最高值40.1–45.9℃,pH值在35d达到8–9。从42d开始,T值降至0.72以下,堆肥结束时,GI达到140.16–155.70%。添加3%石灰氮堆肥未出现高温期,温度范围在19.6–28.7℃,pH值基本高于9。堆肥结束时,T值仍在1左右的高水平,GI达到119.87–129.55%。⑵鲜牛粪堆肥中添加2%和3%石灰氮,对堆肥中富营养菌、贫营养菌和放线菌的变化规律及活性未产生明显影响,对蛋白质分解菌的变化规律有一定影响。添加3%石灰氮对蛋白质分解菌活性未产生明显影响,而添加2%石灰氮则降低蛋白质分解菌活性。对油脂分解菌、淀粉分解菌和纤维素分解菌的变化规律未产生明显影响,添加石灰氮可提高油脂分解菌活性,对淀粉分解菌和纤维素分解菌活性未产生明显影响。⑶鲜牛粪堆肥中添加2%和3%石灰氮,可明显缩短杀灭堆肥中大肠杆菌的时间,同时随石灰氮添加量的增加抑菌效果也明显提高。总之,鲜牛粪堆肥中添加石灰氮,可有效杀灭堆肥中不同血清型牛源致病性大肠杆菌,同时添加2%石灰氮对堆肥化过程的顺利进行不会产生明显影响。由此可见,通过牛粪堆肥中添加石灰氮,既可达到牛粪无害化处理目的,又可实现资源化利用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图和附表清单
• 1 引言
• 1.1 大肠杆菌致病性
• 1.2 大肠杆菌血清型
• 1.3 致病性大肠杆菌感染及流行
• 1.4 畜禽粪便污染
• 1.5 堆肥
• 1.6 石灰氮及其应用
• 1.7 研究目的及主要内容
• 2 牛源致病性大肠杆菌分离鉴定、毒力因子检测以及药物试验
• 2.1 牛源大肠杆菌分离鉴定
• 2.2 多重 PCR 技术检测牛源大肠杆菌毒力因子
• 2.3 草药对不同血清型牛源致病性大肠杆菌抑菌效果
• 3 鲜牛粪堆肥中添加石灰氮对不同血清型牛源致病性大肠杆菌的抑制
• 3.1 鲜牛粪堆肥中牛源致病性大肠杆菌生存及石灰氮抑菌效果
• 3.2 石灰氮对不同血清型牛源致病性大肠杆菌生长繁殖影响
• 3.3 石灰氮对鲜牛粪堆肥中内源性大肠杆菌抑菌效果
• 3.4 石灰氮对鲜牛粪堆肥中嗜温菌和嗜热菌生长影响
• 3.5 牛粪堆肥水分含量对石灰氮抑菌效果影响
• 4 石灰氮对鲜牛粪堆肥化效果影响
• 4.1 试验材料
• 4.2 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 总体讨论与结论
• 5.1 总体讨论
• 5.2 总体结论
• 5.3 研究创新之处
• 5.4 研究未来展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介