猪粪中产淀粉酶、蛋白酶菌株的筛选、鉴定及发酵条件的优化

论文摘要

随着我国养殖业规模的扩大,集约化程度的提高,养殖场废弃物带来的污染问题越来越严重,主要包括畜禽粪便污染及臭气污染。目前,对污染问题的解决方法主要包括两种：一种是粪便排出后的治理,主要通过堆肥技术,添加一些吸附剂,微生物菌剂,尽快实现固体粪便无害化并资源化,减少臭气污染；另一种就是从畜禽粪便排出源头治理,主要通过饲喂微生态制剂、酶制剂,提高畜禽消化率,减少有害微生物在胃肠道中的定植,减少H2S、NH3、挥发性脂肪酸等臭气主要成分的产生。本试验主要从动物粪便,堆肥产品中利用NH3选择性培养基初步筛选出能利用氨态氮的细菌共17株,对这17株菌的产淀粉酶能力、蛋白酶能力进行定量分析,从中筛选出4株产酶活力较高且能利用NH3的菌株,用16SrRNA分子生物学鉴定与传统生理生化鉴定相结合的方法进行鉴定,这4株菌分别是：枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌。并对这4株菌的耐胆盐性、耐酸性、产酸性能、动力生长曲线等生理特性进行研究,其中,这四株菌均可以在胃肠道中存活并保持一定活力,均可以在胆盐浓度为0.03%～0.3%的猪小肠中存活,嗜酸乳杆菌产酸能力较好,在培养基培养48h时的pH为4.73。采用单因素试验设计、Plackett-Burman设计和中心组合设计法（CCD）对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的液体发酵培养条件进行优化,筛选出影响三株菌活菌数的显著因素,通过响应面设计对显著性因素进行分析,确定各因素的最佳水平,并通过验证试验得出结论。各菌株优化的培养基与培养条件为：（1）枯草芽孢杆菌：玉米粉1.607%,胰蛋白胨1.977%, MgSO4·7H2O 0.0183%, MnSO4·H2O 0.102%,37℃,初始pH为7.0；最后验证试验测定活菌数为7.20×109,为理论值的99.6%；（2）嗜热脂肪芽孢杆菌：玉米粉1.534%,豆粕粉3.169%, MgSO4·7H2O 0.331%, MnSO4·H2O 0.219%,37℃,初始pH为7.0；最后验证测得的活菌数为5.90×109,为理论值的99.5%；（3）嗜酸乳杆菌：葡萄糖1.681%,麸皮2.2026%,胰蛋白胨2.098%,K2HPO42.221%,吐温801.152%,37℃,初始pH为6.5；最后验证测得活菌数为9.10×109,为理论值的99.8%。基于优化的培养基条件,对枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌进行5L发酵罐扩大培养,获得了较高的活菌数,比优化前分别提高了1.5和2.1倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 我国畜禽排泄物对环境的污染现状
• 1.2 畜禽排泄物对环境的危害
• 1.2.1 畜禽排泄物对空气质量的危害
• 1.2.2 畜禽排泄物对水体的危害
• 1.2.3 畜禽排泄物对农田的危害
• 1.2.4 畜禽排泄物对传染病的影响
• 1.3 臭气处理技术
• 1.3.1 物理除臭方法
• 1.3.2 化学除臭方法
• 1.3.3 生物除臭方法
• 1.4 微生物鉴定方法
• 1.4.1 常规鉴定方法
• 1.4.2 数值分类法
• 1.4.3 化学分类法
• 1.4.4 分子遗传学分类法
• 1.4.5 微生物鉴定系统
• 1.5 微生物的研究及应用
• 1.5.1 枯草芽孢杆菌的特点及应用
• 1.5.2 嗜热脂肪芽孢杆菌的特点及应用
• 1.5.3 嗜酸乳杆菌的特点及应用
• 1.6 发酵培养基优化方法
• 1.6.1 单因素试验设计
• 1.6.2 正交设计
• 1.6.3 均匀设计
• 1.6.4 响应面设计
• 1.6.5 人工神经网络和遗传算法
• 1.7 微生物培养基优化涉及的软件
• 第二章 目的意义
• 第三章 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂药品及试剂盒
• 3.1.4 缓冲溶液和常用试剂的配置
• 3.1.5 主要设备仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 微生物的分离纯化
• 3的菌株'>3.2.2 筛选能直接利用NH₃的菌株
• 3.2.3 对初筛菌株进行产淀粉酶、蛋白酶能力定量分析
• 3.2.4 菌株的16SrRNA分子生物学鉴定
• 3.2.5 菌株的生理生化鉴定
• 3.2.6 菌株的生物学特性研究
• 3.2.7 各菌株发酵条件的优化
• 3.2.8 枯草芽孢杆菌发酵扩大培养研究
• 3.2.9 嗜酸乳杆菌发酵扩大培养研究
• 第四章 结果与分析
• 4.1 微生物的分离纯化
• 3的菌株'>4.2 筛选能直接利用NH₃的菌株
• 4.3 对初筛菌株进行产淀粉酶、蛋白酶能力定量分析
• 4.3.1 产淀粉酶定量分析
• 4.3.2 产蛋白酶定量分析
• 4.4 菌株的16SRRNA分子生物学鉴定
• 4.5 菌株的生理生化鉴定
• 4.6 菌株的生物学特性研究
• 4.6.1 各菌株耐酸性试验
• 4.6.2 各菌株生长动力曲线测定
• 4.6.3 各菌株耐胆盐试验
• 4.6.4 各菌株产酸能力试验
• 4.7 各菌株发酵条件的优化
• 4.7.1 单因素实验设计
• 4.7.2 Plackett-Burman实验设计
• 4.7.3 最陡爬坡试验
• 4.7.4 中心组合试验
• 4.7.5 模型验证试验
• 4.8 枯草芽孢杆菌5L发酵罐扩大培养研究
• 4.9 嗜酸乳杆菌5L发酵罐扩大培养研究
• 第五章 讨论
• 5.1 关于枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌产酶活力研究及在除臭中的应用
• 5.1.1 关于枯草芽孢杆菌产酶活力及在除臭中的应用研究
• 5.1.2 关于嗜热脂肪芽孢杆菌产酶活力及在除臭中的应用研究
• 5.1.3 关于嗜酸乳杆菌产酶活力及在除臭中的应用研究
• 5.2 微生物的鉴定方法
• 5.3 影响各菌株活菌数的因素
• 5.4 响应面法优化发酵培养基
• 第六章 小结与展望
• 6.1 本研究所取得的成果
• 6.2 下一步值得研究的工作
• 参考文献
• 致谢