enJSRV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫和胚胎中的表达与定位

论文摘要

在长期进化过程中整合于脊椎动物基因组中的某些内源性逆转录病毒,在胎盘形成过程扮演重要角色,起到增强遗传基因功能,并保护宿主免受相关外源致病性病毒侵害的作用。绵羊基因组中含有与外源性绵羊肺腺瘤逆转录病毒（exogenous jaagsiekte sheep retrovirus,exJSRV）密切相关的约20拷贝内源性逆转录绵羊肺腺瘤病毒（endogenous jaagsiekte sheep retrovirus,enJSRV）序列,其中exJSRV是绵羊肺腺瘤病（ovine pulmonary adenomatosis,OPA）的致病因子,而透明质酸酶2（hyaluronidase 2,HYAL2）则是enJSRV和exJSRV的共同受体。但enJSRV与其受体HYAL2在绵羊胚胎发育过程中所发挥的确切作用仍不明了。为了探索妊娠蒙古绵羊子宫和胚胎中是否存在enJSRV和受体HYAL2基因的表达及作用,本试验首先随机抽取妊娠27d、56d、91d和107d蒙古绵羊的子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎为研究材料,采用半定量RT-PCR技术进行了初步探究。随后设计特异性引物和Taq Man探针,建立了实时荧光定量RT-PCR技术检测enJSRV及其受体HYAL2 mRNAs的方法,并运用该方法比较系统地对enJSRV及其受体HYAL2 mRNAs在不同妊娠时期（30d、50d、70d、90d、110d和130d）蒙古绵羊子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎中的表达情况进行了检测分析。然后分别将enJSRV及其受体HYAL2的RT-PCR产物纯化进行地高辛探针的标记,优化组织原位杂交技术,并应用该方法检测了enJSRV及其受体HYAL2 mRNAs在不同妊娠时期（30d、50d和130d）蒙古绵羊子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎组织的空间定位。研究结果表明:1.在妊娠27d、56d、91d和107d蒙古绵羊的子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎中,均获得了条带单一的enJSRV及其受体HYAL2扩增片段,且该片段与GenBank中的已登录的绵羊enJSRV和HYAL2同源性分别达到95.9%和98.3%。证实enJSRV及其受体HYAL2 mRNAs在蒙古绵羊不同妊娠时期的子宫和胚胎组织中均有表达。因此,本项研究为深入探究enJSRV及其受体HYAL2在蒙古绵羊妊娠期的生殖生物学作用奠定了基础。2.蒙古绵羊在不同妊娠时期（30d、50d、70d、90d、110d和130d）子宫和胚胎组织中均有enJSRV mRNA表达。通过统计学分析得出:胎盘组织中enJSRV基因的表达于90d时达到高峰,然后开始下降,直至妊娠130d时表达量达到最低;子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达于30d和50d相对较高;绒毛膜组织中enJSRV mRNA的表达于妊娠50d时表达量最低,70d和110d相对较高。序列测定结果显示,enJSRV基因片段与GenBank中的已登录的5种enJSRV序列的同源性为100%。提示enJSRV的表达与妊娠期子宫内的结构变化和功能有关,为进一步研究enJSRV在妊娠蒙古绵羊子宫和胚胎组织细胞中的空间定位及生物学作用奠定了重要基础。3.蒙古绵羊在在不同妊娠时期（30d、50d、70d、90d、110d和130d）子宫和胚胎组织中均有HYAL2 mRNA表达。通过统计学分析得出:HYAL2 mRNA于蒙古绵羊妊娠30d子宫内膜和胎盘相对较高,于妊娠130d子宫内膜、绒毛膜和胎盘相对较低。序列测定结果显示,HYAL2基因片段与GenBank中的已登录的5种HYAL2序列的同源性为91.9%。而enJSRV与其受体HYAL2 mRNA之间无线性相关性,这可能由于二者的表达调控机制不同所致。4.应用组织原位杂交技术检测enJSRV及其受体HYAL2 mRNAs在不同妊娠时期（30d、50d和130d）蒙古绵羊子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎组织的空间定位,结果显示,enJSRV及其受体HYAL2 mRNAs的阳性信号,出现于腔上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞、肉阜、胎盘绒毛叶及妊娠30d的胚胎组织。该试验结果为目前众多学者公认的多核合胞体形成假说,提供了有力的形态学依据。本项研究是国内首次对enJSRV及其受体HYAL2的表达特性及空间定位进行的初步探寻,为深入研究enJSRV及其受体HYAL2在滋养层细胞的分化、移行、融合,胎盘形成、胚胎发育及防御外源性病毒菌的侵入等过程中的生殖生物学作用提供了可靠依据,并为进一步揭示胎盘功能开辟了又一有益途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 内源性反转录病毒的研究进展
• 1.2 enJSRV 基因结构特点（与外源性绵羊肺腺瘤逆转录病毒相比较）
• 1.3 绵羊肺腺瘤病（OPA）概述
• 1.3.1 绵羊肺腺瘤病的病原学和流行病学
• 1.3.2 OPA 的临床症状和病理变化
• 1.3.3 OPA 的诊断和防治
• 1.3.4 OPA 的发病机理
• 1.4 enJSRV 在 OPA 发生过程中的作用
• 1.5 enJSRV 在染色体中的分布
• 1.6 enJSRV 对胎盘形成的影响
• 1.7 母羊年龄和机体状况对enJSRV 表达的影响
• 1.8 孕酮及 IFN-τ对enJSRV 表达的调节作用
• 1.9 enJSRV 在宿主细胞中的进化
• 1.10 妊娠过程中子宫内膜、绒毛膜、胎盘和胚胎的变化
• 1.10.1 子宫内膜的形成及妊娠期的变化
• 1.10.2 绒毛膜的形成及妊娠期的变化
• 1.10.3 胎盘的形成及妊娠期的变化
• 1.10.4 胚胎的形成及妊娠期的变化
• 1.11 研究的目的及意义
• 2 试验一 enJSRV 及其受体在蒙古绵羊子宫和胚胎组织中的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验动物及组织
• 2.1.2 主要仪器及试剂
• 2.1.3 PCR 引物的设计及合成
• 2.1.4 妊娠蒙古绵羊子宫和胚胎组织总 RNA 的提取及检测
• 2.1.5 RT-PCR 反应
• 2.1.6 RT-PCR 产物的回收与序列测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 妊娠蒙古绵羊子宫和胎盘组织总 RNA 的检测结果
• 2.2.2 enJSRV 及其受体基因 RT-PCR 扩增结果
• 2.2.3 enJSRV 及其受体 HYAL2 基因 RT-PCR 产物序列测定的分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 试验二 enJSRV 在不同妊娠时期蒙古绵羊子宫和胚胎组织的定量表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验动物及组织
• 3.1.2 主要仪器及试剂
• 3.1.3 PCR 引物和探针的设计与合成
• 3.1.4 妊娠蒙古绵羊子宫和胚胎组织总 RNA 的提取
• 3.1.5 Taq Man 探针实时荧光定量 RT-PCR 反应
• 3.1.6 荧光定量 PCR 稳定性和重复性的检测
• 3.1.7 标准曲线的建立
• 3.1.8 妊娠蒙古绵羊各时期子宫和胚胎组织enJSRV 基因表达水平的检测
• 3.1.9 enJSRV 基因cDNA 的克隆与鉴定
• 3.1.10 试验数据处理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 妊娠蒙古绵羊子宫和胚胎组织总 RNA 的检测结果
• 3.2.2 荧光定量 PCR 的稳定性和重复性
• 3.2.3 enJSRV 和β-actin 实时荧光定量 PCR 扩增曲线分析
• 3.2.4 enJSRV 基因相对表达水平的检测
• 3.2.5 实时荧光定量 PCR 扩增片段的鉴定结果
• 3.2.6 荧光定量 PCR 产物克隆测序的结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 试验三 受体 HYAL2 在不同妊娠时期蒙古绵羊子宫和胚胎组织的定量表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验动物及组织
• 4.1.2 主要仪器及试剂
• 4.1.3 PCR 引物和探针的设计与合成
• 4.1.4 妊娠蒙古绵羊子宫和胚胎组织cDNA 的复检
• 4.1.5 Taq Man 探针实时荧光定量 PCR 反应的建立
• 4.1.6 妊娠蒙古绵羊各时期子宫和胚胎组织 HYAL2 基因表达水平的检测
• 4.1.7 HYAL2 cDNA 的克隆与鉴定
• 4.1.8 试验数据处理
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 妊娠蒙古绵羊子宫和胚胎组织cDNA 的复检结果
• 4.2.2 HYAL2 和β-actin 实时荧光定量 PCR 扩增曲线分析
• 4.2.3 HYAL2 基因相对表达水平的检测
• 4.2.4 实时荧光定量 PCR 扩增片段的鉴定结果
• 4.2.5 荧光定量 PCR 产物克隆测序的结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 试验四 enJSRV 及其受体在蒙古绵羊子宫和胚胎组织中的空间定位
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验动物及其组织
• 5.1.2 主要仪器和试剂
• 5.1.3 主要试剂的配制
• 5.1.4 SP 正、反义 RNA 探针的制备及检测
• 5.1.5 原位杂交
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 SP 正、反义 RNA 探针的制备及检测结果
• 5.2.2 原位杂交检测结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 原位杂交技术的优化及影响因素
• 5.3.2 enJSRV 及其受体 HYAL2 mRNAs 在蒙古绵羊子宫和胚胎中的定位
• 5.4 小结
• 6 总体结论与创新点
• 6.1 总体结论
• 6.2 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介