铜绿假单胞菌中吩嗪对外排泵MexGHI-OpmD调节机理的研究

论文摘要

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是一类革兰氏阴性机会致病菌,能够在人类身上引起急慢性感染,是肺纤维囊肿病人致死的主要原因。PA可以分泌多种胞外毒性因子,从而引起广泛的组织感染损伤,最终引起全身性的毒性因子散布以及感染。吩嗪是铜绿假单胞菌生长过程中分泌的一类次级代谢产物,它作为一种致病因子影响PA的致病能力,同时吩嗪还可以作为小分子信号物质对铜绿假单胞菌很多基因有明显的调节作用。本实验室以前的研究表明,吩嗪（绿脓菌素,pyocyanin）对外排泵基因mexGHI-opmD的表达具有强烈的激活作用,而mexGHI-opmD可以介导对四环素、替卡西林钠-克拉维酸钾以及奈替米星等抗生素的抗性。然而吩嗪对外排泵mexGHI-opmD表达调节的分子机理尚不清楚。本研究以绿脓菌素（pyocyanin, PYO,一种吩嗪化合物）对mexGHI-opmD的表达调节为对象,旨在了解其调节途径及调节机理。研究利用转座子pBT20对野生型PAO1（CTX-mexG）进行随机饱和转座突变,在PYO条件下,共筛选到17株调节外排泵mexGHI-opmD表达的突变体,通过随机PCR及序列比对后,最终确定了突变体中转座子的插入位置,从而确定了调节基因。我们对所筛选出的部分转座突变体进行了一系列的表型测定实验,比如细菌运动性,抗生素敏感性、刚果红实验等；在对实验表型进行分析后,我们选取37号转座突变体进行了深入的研究,该转座突变体被破坏的基因为PA2621,从PA的基因组数据库中的信息可知,基因PA2621和PA2620属于同一个操纵子。基因互补实验表明,在有无PYO的条件下,基因PA2621和PA2620对mexGHI-opmD均有一定的正调节作用。为了确定这两个基因的功能我们对敲除突变体PAO1（Δ2621）和PAO1（Δ2620）进行了一系列的表型测定实验。测定了PAO1（Δ2621）和PAO1（Δ2620）的细菌运动性,刚果红表型、绿脓菌素产量、蛋白水解酶能力、对抗生素的抗性以及群体感应系统基因和三型分泌系统基因在突变体中的表达情况等。研究结果表明,相比野生型PAO1,PA2621和PA2620突变体的绿脓菌素产量增加；运动性、刚果红、蛋白水解酶能力没有明显变化；对羧苄青霉素等抗生素的抗性明显增强,而对利福平更加敏感。铜绿假单胞菌中,吩嗪的合成受群体感应系统的严格控制。同时,有研究表明吩嗪化合物PYO是群体感应系统的终信号分子。本研究的实验结果显示,群体感应系统基因和三型分泌系统基因在PA2621突变体中表达明显降低。但是pqsS、lasR、rhlR、exoS和exoY基因在PA2620突变体中的表达提高,pqsH、pqsR、rhlI和exoT基因在PA2620突变体中的表达降低。上述研究结果表明,基因PA2621和PA2620与铜绿假单胞菌的耐药性、群体感应系统、三型分泌系统密切相关。基因PA2621和PA2620在吩嗪调节mexGHI-opmD的途径中起介导作用,这为进一步确定吩嗪激活外排泵mexGHI-opmD表达的内在机理提供了线索。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 图表目录
• 缩写对比表
• 第一章 绪论
• 1.1 铜绿假单胞菌的耐药性
• 1.1.1 改变抗菌药物作用的靶位
• 1.1.2 独特的药物主动外排系统
• 1.1.3 生物被膜
• 1.1.4 产生抗生素灭活酶或抗生素修饰酶
• 1.1.5 外膜低通透性
• 1.2 铜绿假单胞菌RND外排泵及外排泵MexGHI-opmD的研究进展
• 1.2.1 铜绿假单胞菌的RND外排泵及其结构
• 1.2.2 铜绿假单胞菌的RND外排泵与细菌的耐药性
• 1.2.3 铜绿假单胞菌外排泵MexGHI-OpmD简介
• 1.2.4 铜绿假单胞菌外排泵MexGHI-OpmD与细菌的耐药性
• 1.2.5 铜绿假单胞菌外排泵MexGHI-OpmD与群体感应系统及绿脓菌素的关系
• 1.3 抗生素的分类、特性以及现状
• 1.4 铜绿假单胞菌的群体感应系统（Quorum sensing system,QS system）
• 1.4.1 Las和Rhl系统
• 1.4.2 PQS系统
• 1.5 吩嗪的生物活性及调节途径
• 1.5.1 吩嗪化合物的合成及基本特性
• 1.5.2 铜绿假单胞菌中绿脓菌素（PYO）和群体感应系统的关系
• 1.6 铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的组成及调控
• 1.7 本课题的研究内容和目的
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株、质粒和引物
• 2.1.2 培养基的配制及各种抗生素的使用浓度
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 基本的实验方法
• 2.2.1 质粒的小量提取
• 2.2.2 琼脂糖凝胶DNA片段纯化回收
• 2.2.3 细菌基因组DNA的提取
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 铜绿假单胞菌感受态细胞的快速制备
• 2.2.6 电转化
• 2.2.7 聚合酶链式反应（PCR）的反应体系（100μl）
• 2.2.8 酶切和连接反应
• 2.2.9 基因表达载体的构建
• 2.2.10 基因表达水平的测定
• 2.2.11 双亲株实验
• 2.2.12 启动子-报到子整合体系的构建
• 2.3 绿脓菌素（pyocyanin,PYO）激活下MexGHI-opmD调节基因的筛选
• 2.3.1 固体平板中绿脓菌素（PYO）浓度与MexGHI-OpmD表达激活的关系
• 2.3.2 液体培养基中绿脓菌素（PYO）浓度与MexGHI-OpmD表达激活的关系
• 2.3.3 转座突变
• 2.3.4 转座突变体的筛选
• 2.3.5 随机PCR
• 2.3.6 转座子插入位点的确定
• 2.3.7 基因互补实验
• 2.3.8 基因过量表达实验
• 2.4 基因功能的研究
• 2.4.1 细菌的运动实验
• 2.4.2 刚果红实验
• 2.4.3 绿脓菌素的测定
• 2.4.4 蛋白水解酶活力测定
• 2.4.5 最小抑制浓度（MIC）的测定
• 2.4.6 细菌抗生素敏感性实验
• 2.4.6.1 平板滤纸片法测定抗生素的敏感性
• 2.4.6.2 平板CFU法测定抗生素的敏感性
• 第三章 实验结果
• 3.1 PYO浓度与外排泵MexGHI-OpmD表达激活的关系
• 3.1.1 固体平板中PYO浓度与MexGHI-OpmD表达激活的关系
• 3.1.2 液体培养基中PYO浓度与MexGHI-OpmD表达激活的关系
• 3.2 转座突变体库的构建及转座突变体的筛选
• 3.2.1 随机转座突变体文库的筛选
• 3.2.2 转座突变体突变基因的确定
• 3.3 转座突变体菌株表型的测定
• 3.3.1 绿脓菌素（pyocyanin）的测定
• 3.3.2 细菌运动性实验
• 3.3.3 蛋白水解酶的测定
• 3.3.4 刚果红实验
• 3.3.5 转座突变体的抗生素敏感性实验
• 3.3.5.1 平板滤纸片法测定转座突变体对抗生素的敏感性实验
• 3.3.5.2 转座突变体最小抑制浓度（MIC）的测定
• 3.3.5.3 平板CFU法测定转座突变体对抗生素的敏感性实验
• 3.4 PA2621和PA2620对外排泵MexGHI-opmD的调节
• 3.4.1 37号转座突变体的互补实验
• 3.4.2 PA2621和PA2620基因高表达对外排泵基因mexGHI-opmD的调节
• 3.4.3 载体pKD-mexG在ΔPA2621和ΔPA2620中的表达
• 3.5 PA2621和PA2620基因功能的研究
• 3.5.1 突变体表型的测定
• 3.5.1.1 绿脓菌素（pyocyanin）的测定
• 3.5.1.2 运动性的测定
• 3.5.1.3 蛋白水解酶的测定
• 3.5.1.4 刚果红实验
• 3.5.1.5 突变体的抗生素敏感性实验
• 3.5.1.5.1 平板滤纸片法测定突变体对抗生素的敏感性实验
• 3.5.1.5.2 突变体的最小抑制浓度（MIC）的测定
• 3.5.1.5.3 平板CFU法测定转座突变体对抗生素的敏感性实验
• 3.5.2 载体pKD-rsmA在APA2621和ΔPA2620中的表达
• 3.5.3 PA2621、PA2620和PQS系统之间的关系
• 3.5.4 PA2621、PA2620和QS系统（Las和Rhl系统）之间的关系
• 3.5.5 PA2621、PA2620和三型分泌系统（Type Ⅲ secretion system,T3SS）之间的关系
• 第四章 结论及讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢