乙肝病毒核心蛋白参与肝癌发生的生物学作用与机制探讨

论文摘要

研究目的：1.探讨HBc蛋白在肝癌发生发展中的作用,进一步解读其生物学功能。2.筛选出在HBc参与肝癌发生中发挥作用的关键分子,以期进一步阐明HBV相关HCC发生的分子机制,获得新的肝癌生物治疗靶点和肿瘤诊断标志物。研究方法：一、乙肝病毒核心蛋白（HBc）真核表达载体的构建与表达1.构建HBc融合表达载体pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc根据PubMed中HBc序列,利用Primer Premier5.0软件,设计扩增带有HindⅢ和EcoRV或HindⅢ和BamHI不同酶切位点的特异性引物,并在构建pcDNA3. 0-HBc-HA载体的下游引物引入HA-tag序列。以pUC19/3. OHBV为模板,分别以二对引物扩增HBc。PCR产物经双酶切、回收后分别克隆入pcDNA3.0及pEGFP-N1载体。连接产物转化大肠杆菌JM109, LA平板筛选挑取阳性重组子,并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定,分别命名为pcDNA3. 0-HBc-HA和pEGFP-HBc。2.HBc真核表达质粒在肝癌细胞中的表达常规转染含有HBc的真核表达质粒及其对照质粒,分别收集处于对数生长期的BEL7402-pcDNA3.0、BEL7402-pcDNA3. 0-HBc-HA、BEL7402-pEGFP-N1、BEL7402-pEGFP-HBc细胞。首先用Trizol方法提取细胞总RNA,在mRNA水平检测HBc基因的表达。然后常规收集BEL7402-pcDNA3.0和BEL7402-pcDNA3. 0-HBc-HA细胞蛋白,Western blot方法检测其蛋白水平的表达；同时将pEGFP-HBc转染组及pEGFP转染组细胞培养板置于荧光显微镜下,观测绿色荧光蛋白的表达情况,拍照记录结果。3. pEGFP-HBc重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定将pEGFP-N1或pEGFP-HBc质粒分别转染BEL7402细胞,转染后24h,将细胞传代至6孔板中,并加入选择性药物新霉素G418,挑选阳性克隆。未转染细胞在G418的作用下逐渐死亡,而转染细胞具有G418抗性,形成细胞克隆。阳性克隆经稳定传代培养,建立可稳定表达HBc基因的肝癌细胞系,并在mRNA及蛋白水平验证HBc的表达。二、乙肝病毒核心蛋白对肝癌细胞系生物学功能的影响1.正反向论证HBc蛋白对肝癌细胞生长的影响取生长状态良好的HepG2和BEL7402细胞,分别以1×104个／孔接种于96孔板中,次日分别将重组质粒pEGFP-HBc及对照质粒pEGFP-N1转染HepG2和BEL7402细胞,转染之后每隔24h,用CCK-8检测细胞生长情况,连续检测5天,绘制生长曲线,观察HBc对细胞生长的影响。相同方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1稳筛细胞系的生长情况,以及小干扰RNA封闭HBc前后HepG2.2.15细胞的生长情况。2.正反向论证HBc蛋白对肝癌细胞集落形成能力的影响取生长状态良好的HepG2和BEL7402细胞,以3×105个／孔接种于24孔板中,次日分别将重组质粒pEGFP-HBc及pEGFP-N1对照质粒转染HepG2和BEL7402细胞,转染之后24h,将细胞经胰酶消化后,以适当的细胞密度接种于六孔板中,静置培养2-3周,之后用龙胆紫染色,肉眼计数细胞克隆数,计算克隆形成率。相同方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1稳筛细胞系的集落形成能力,以及小干扰RNA封闭HBc前后HepG2.2.15细胞的集落形成能力。3.HBc对BEL7402细胞系细胞周期的影响BEL7402细胞常规转染pEGFP-HBc及pEGFP-N1质粒24h后,胰酶消化制备单细胞悬液,80%乙醇固定,PI染色30min后上样流式细胞仪检测细胞周期。相同方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1稳筛细胞系间细胞周期的差异。4.HBc对血清饥饿诱导细胞凋亡的影响取对数生长期的稳定转染的BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞,接种于24孔板内。20h后,更换成含0.1%FCS的低血清培养基,继续培养72h后,消化、收集细胞（包括上清中漂浮的细胞）,PBS洗涤,TUNEL染色,流式细胞仪检测、分析细胞的凋亡率。5.HBc对肝癌细胞的运动力及侵袭力的影响取对数生长期的稳定转染的BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞悬液,分别接种于铺或未铺matrigel的24孔板中,培养24h（检测运动力时为8h）将各小室取出,用湿棉棒轻轻擦去上室中细胞,固定,待小室膜风干后置入到有结晶紫染液的孔中,染色20min,取出小室,用流水冲干净显微镜下计数10个高倍镜视野,计算整个小室膜上穿膜细胞数。三.HBc参与肝癌发生中的分子机制研究1.HBc蛋白对肝癌细胞中抑癌基因DLC-1的表达调控作用BEL7402细胞中过表达HBc, Realtime-PCR的方法检测DLC-1表达的变化,同时反义封闭HepG2.2.15细胞中HBc基因的表达,RT-PCR检测DLC-1表达变化,并用实时荧光定量PCR检测HBV转基因小鼠和正常BALB/c小鼠肝组织中DLC-1基因的表达差异。2.乙肝病毒核心蛋白反式激活端粒酶逆转录酶表达和活性的研究BEL7402细胞中系列梯度转染HBc表达质粒,RT-PCR的方法检测hTERT的表达变化,同时系列梯度反义封闭HepG2.2.15细胞中HBc基因的表达,RT-PCR检测hTERT的表达变化。PCR-TRAP方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1稳筛细胞系间hTERT活性。研究结果一、乙肝病毒核心蛋白HBc真核表达载体的构建与表达1.成功构建融合表达载体pcDNA3.0-HBc-HA和pEGFP-HBc以pUC19/3.OHBV为模板,分别以二对引物PCR扩增不同的HBc基因片段。PCR产物分别经HindⅢ和EcoRV或HindⅢ和BamHI双酶切,回收后分别克隆入经相同双酶切的pcDNA3.0及pEGFP-N1载体,构建真核融合表达质粒,命名为pcDNA3. 0-HBc-HA和pEGFP-HBc。两种重组质粒分别以HindⅢ、BamHI做单酶切,HindⅢ和EcoRV及HindⅢ和BamHI双酶切,分别获得与预期大小一致的目的片段；进一步用PCR及DNA测序证明pcDNA3.O-HBc-HA和pEGFP-HBc重组载体构建成功。2.HBc融合表达质粒在肝癌细胞可高水平表达HBc mRNA和融合蛋白RT-PCR检测转染BEL7402细胞中HBc mRNA的表达,可见空载体pcDNA3.0和pEGFP-N1转染组细胞中未检测到HBc mRNA的表达,而pcDNA3. 0-HBc-HA和pEGFP-HBc转染组细胞均可检测到高水平HBc mRNA的表达。Western Blot检测HBc-HA融合蛋白的表达情况,pcDNA3.0转染组细胞未检测到阳性条带,而pcDNA3. 0-HBc-HA转染组则可见较强的HBc-HA融合蛋白的表达。另取转染48h后的pEGFP-HBc转染组及pEGFP-N1转染组细胞,置于荧光显微镜下,两组细胞均可观察到较强的绿色荧光蛋白的表达。3.成功建立稳定转染pEGFP-N1和pEGFP-HBc质粒的肝癌细胞系质粒pEGFP-N1、pEGFP-HBc经脂质体介导分别转染处于对数生长期的肝癌细胞BEL7402,用含G418的培养液筛选转染阳性细胞,约3-4周后出可在荧光显微镜下见到明显的阳性细胞克隆。经筛选得到阳性克隆,分别命名为BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞,并在BEL7402-pEGFP-HBc细胞中检测到高水平HBc mRNA和蛋白的表达。二、乙肝病毒核心蛋白对肝癌细胞系生物学功能的影响1.HBc蛋白可促进肝癌细胞的生长BEL7402细胞经稳定或瞬时转染pEGFP-HBc质粒后,细胞的生长能力显著高于空载体转染组细胞,且在HepG2细胞中得到相似的结果,表明HBc蛋白的表达可增强肝癌细胞的生长能力。2.HBc蛋白可增强肝癌细胞的集落形成能力BEL7402细胞、HepG2细胞经稳定或瞬时转染pEGFP-HBc质粒后,细胞的克隆增殖能力显著高于空载体转染组细胞,表明HBc蛋白的表达可增强肝癌细胞的集落形成能力。3.HBc可促使细胞周期进入S期BEL7402细胞稳定或瞬时表达HBc表达质粒后,G0／G1期细胞比例显著降低,而S期细胞显著升高,表明HBc蛋白可能通过干扰细胞周期,进而促进细胞的生长和增殖能力。4.HBc促使细胞抵抗血清饥饿诱导的细胞凋亡血清饥饿法处理BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-Nl细胞,TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示,BEL7402-pEGFP-HBc细胞凋亡率显著低于对照组细胞,该结果与前期研究发现的HBc蛋白可下调细胞对TRAIL诱导凋亡敏感性的结果相一致,表明HBc可使细胞抵抗不同刺激诱导的凋亡。5.HBc可增强肝癌细胞的运动力及侵袭力Transwell方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞的运动力和侵袭力。结果显示,稳定表达HBc蛋白的BEL7402细胞系与对照细胞相比,其运动力及侵袭力均有明显增强,表明HBc蛋白可能影响肿瘤细胞的体内转移过程。三.HBc参与肝癌发生中的分子机制研究1.HBc蛋白可下调肝癌细胞中抑癌基因DLC-1的表达将HBc表达质粒或其对照质粒转染肝癌细胞BEL7402,48h后,收集细胞总RNA, RT-PCR检测抑癌基因DLC-1的表达。结果显示,与对照组相比,HBc的表达可显著下调BEL7402细胞中DLC-1 mRNA水平。利用反义寡核苷酸特异性封闭HepG2.2.15细胞中HBc基因的表达,48h后收集细胞总RNA, RT-PCR结果显示DLC-1在mRNA水平表达有明显升高。另外提取HBV转基因小鼠及正常对照小鼠的肝组织RNA,实时定量PCR结果显示HBV转基因小鼠肝组织中DLC-1表达水平明显低于对照组小鼠。2.HBc蛋白反式激活端粒酶逆转录酶的表达和活性肝癌细胞BEL7402中梯度转染HBc表达质粒,48h后,收集细胞总RNA,RT-PCR检测显示,随着HBc表达水平的增加BEL7402细胞中hTERT mRNA水平亦呈现增高趋势。HepG2.2.15细胞中转染入针对HBc的小干扰RNA载体,48h后收集细胞总RNA, RT-PCR结果显示HBc表达水平的下调hTERT mRNA水平呈现下降趋势。另外,PCR-TRAP方法检测BEL7402-pEGFP-HBc和BEL7402-pEGFP-N1细胞中端粒酶活性,结果显示,BEL7402-pEGFP-HBc细胞端粒酶活性显著高于对照组细胞。结论及意义：1.本研究成功构建了两个可在肝癌细胞中有效表达HBc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3. 0-HBc-HA和pEGFP-HBc,为进一步研究HBc的功能提供了必要的条件。2.首次对HBc蛋白在肝癌发生中的生物学作用进行研究,并证明HBc可增强肝癌细胞的生长增殖能力,为进一步深入研究HBc的功能提供了新的方向,同时也为发现肝癌治疗新靶点提供实验理论依据。3.首次深入探讨HBc蛋白参与肝癌发生的分子机制,并筛选出可能在HBc致肝癌中发挥重要作用的两个分子DLC-1和hTERT,为进一步阐明了HBV相关肝癌的发病机制提供了新的切入点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 乙肝病毒核心蛋白参与肝癌发生的生物学作用与机制探讨
• 前言
• 技术路线
• 第一章 乙肝病毒核心蛋白HBc真核表达载体的构建与表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第二章 乙肝病毒核心蛋白对肝癌细胞系生物学功能的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第三章 HBc在肝癌发生中的分子机制研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 SLE患者外周血单个核细胞Tim-4基因的表达
• 前言
• 技术路线
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 研究生期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表