贪噬菌CGMCC 4969的噻虫啉水解酶基因簇共表达促进噻虫啉和3-氰基吡啶生物转化的研究

论文摘要

本实验室前期研究发现Variovorax boronicumulans CGMCC 4969可将噻虫啉（THI）的氰基水解生成酰胺噻虫啉（THI amide）。V. boronicumulans CGMCC 4969的腈水合酶（TNHase）包括三个开放阅读框（TnhA.TnhB和TnhC）。在Escherichia coli BL21重组表达了TNHase的α和β亚基（TnhA和TnhB）,但存在包涵体严重、活性较低等问题。本文研究了TnhC的共表达对TNHase表达水平和生物活性的影响,并进一步优化了TNHase的表达和转化条件。本文将TnhA、TnhB和TnhC基因连接到表达载体pET28a上,分别在E. coli BL21（DE3） plysS和E. coli Rosetta （DE3） plysS中进行诱导表达,实验结果显示TNHase在Rosetta中表达时,活性高于在BL21中表达。利用Rosetta作为宿主,将TnhA、TnhB和TnhC基因和来自pET28a质粒的SD序列按照不同的组合和顺序进行诱导表达,结果表明TnhAB与TnhC的顺序及SD序列的有无对TNHase的异源重组表达水平有重要影响。当仅表达TnhAB时,重组蛋白主要以包涵体形式存在；当TnhC位于TnhAB后时,TnhC的表达量少,TnhAB的可溶性没有改善；当TnhC位于TnhAB前时,TnhC表达量很大,且可溶性较好,但TnhA和TnhB的表达量较低；当TnhC位于TnhAB前并在其之间引入一段SD序列时,TnhA、TnhB和TnhC表达量均较高,并均以可溶性蛋白的形式存在。静息转化实验表明pNABC、pNAB、pNCAB和pNCDAB四种质粒的诱导表达菌株降解THI的半衰期分别为4.0,99.0,59.2和13.4min。当TnhC位于TnhAB后共表达时,虽然无法改善重组蛋白的表达水平,但TNHase转化THI的能力较仅表达TnhAB时提高了14.8倍；而当TnhC位于TnhAB前共表达时,由于TnhA和TnhB的表达量较低,TNHa se转化THI的能力降低了0.4倍；当TnhC位于TnhA B前并在其之间引入一段SD序列时,虽然显著改善了重组蛋白的可溶性,但TNHase转化THI的能力仅提高了4.4倍。本文进一步优化了TNHase的表达和静息转化条件。实验结果表明重组表达的TNHase静息转化THI的最优条件是pH为7.0-8.0、温度为25-35℃、Co2+的浓度为0.2-0.3 mmol/L。上述重组菌株的TNHase具有将3-氰基吡啶转化为烟酰胺的能力,实验结果同样显示TNHase在Rosetta中表达时,重组酶转化3-氰基吡啶的活性高于在BL21中表达,同时TnhAB和TnhC的共表达同样可提高该活性。静息转化3-氰基吡啶时,TNHase的最优表达条件为,Rosetta-pNABC在含有0.2mmol/L的Co2+的培养基中培养到OD600为0.7时加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导表达；TNHase的最优静息转化条件为pH为7.0、温度为25℃。本文的实验结果证明TnhC的共表达可以明显的改善TNHase的表达水平,并显著提高重组表达的TNHase静息转化THI的活性。同时本文还优化了’rNHase的表达和静息转化3-氰基吡啶的条件。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 一、烟碱类杀虫剂及噻虫啉的概述
• 二、烟碱类杀虫剂THI的代谢途径研究
• 1 THI在植物和动物中的代谢
• 2 THI在土壤中的代谢
• 三、腈水合酶的研究
• 四、Variovorax的国内外研究现状
• 五、本论文的研究思路
• 第二章 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶基因及激活蛋白的克隆表达和酶活检测
• 第一节 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶基因及激活蛋白基因原核表达载体的构建
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基的配制
• 1.3 主要试剂及来源
• 1.4 主要仪器设备及其来源
• 1.5 主要溶液配制
• 1.6 酶和试剂盒
• 1.7 PCR引物
• 1.8 菌株保藏
• 2 实验方法
• 2.1 基因组DNA的提取
• 2.2 设计引物进行PCR扩增
• 2.2.1 TNHase（TnhA+TnhB）基因的克隆
• 2.2.2 TnhC基因的克隆
• 2.2.3 TNHase（TnhA+TnhB）+TnhC基因的克隆
• 2.2.4 TnhC+TNHase（TnhA+TnhB）基因的克隆
• 2.2.5 TnhC+SD序列+TNHase（TnhA+TnhB）基因的克隆
• 2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 PCR产物回收
• 2.5 PCR产物装TA克隆
• 2法制备感受态细胞'>2.6 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.7 感受态细胞的热休克转化和稀释涂布
• 2.8 克隆载体的阳性筛选
• 2.9 表达载体的阳性筛选
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二节 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶基因及激活蛋白基因在大肠杆菌中的表达
• 1 实验材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 培养基的配制
• 1.3 主要试剂及来源
• 1.4 主要仪器设备及其来源
• 1.5 主要溶液配制
• 2 实验方法
• 2.1 目的蛋白的诱导表达
• 2.2 SDS-PAGE检测蛋白表达
• 2.3 Western blot检测目的蛋白的表达情况
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第三节 V. boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶及激活蛋白的酶活性测定分析
• 1 实验材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 培养基的配制
• 1.3 主要试剂及来源
• 1.4 主要仪器设备及其来源
• 2 实验方法
• 2.1 目的蛋白的诱导表达
• 2.2 静息细胞转化噻虫啉
• 2.3 高效液相色谱（HPLC）分析
• 2.4 THI土壤半衰期
• 3 结果
• 3.1 蛋白表达宿主菌的优化
• 3.2 静息细胞转化条件的优化
• 3.2.1 pH的优化
• 3.2.2 温度的优化
• 2浓度的优化'>3.2.3 CoCl₂浓度的优化
• 3.3 不同质粒表达的TNHase的活性
• 3.4 重组表达的TNHase的底物特异性
• 4 讨论
• 第三章 腈水合酶重组表达菌株转化3-氰基吡啶研究
• 1 实验材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 培养基的配制
• 1.3 主要试剂及来源
• 1.4 主要仪器设备及其来源
• 2 实验方法
• 2.1 目的蛋白的诱导表达
• 2.2 静息细胞转化3-氰基吡啶
• 2.3 高效液相色谱（HPLC）分析
• 3 结果
• 3.1 静息细胞转化3-氰基吡啶结果
• 3.2 蛋白表达条件和发酵条件的优化
• 3.2.1 蛋白表达宿主菌的优化
• 2+浓度的优化'>3.2.2 诱导剂种类和浓度,诱导时机及Co²⁺浓度的优化
• 3.2.3 发酵条件的优化
• 3.3 酶活性的检测
• 4 讨论
• 总结
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 参考文献
• 致谢