鸭肠炎病毒糖蛋白gC基因的克隆、表达及部分功能的研究

论文摘要

鸭病毒性肠炎（duck virus enteritis,DVE）,又名鸭瘟（duck plague virus）,是由鸭肠炎病毒（duck enteritis virus,DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾在多个国家和地区发生流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV是疱疹病毒科成员,第八次国际病毒分类报告将其划分为疱疹病毒科未分类病毒属。糖蛋白C（gC）是疱疹病毒的第二种主要囊膜蛋白,它对病毒的吸附、释放和毒力起着重要作用,而且能诱导中和抗体产生。因此,对gC蛋白的研究不仅对病毒分子生物学功能特征有重要意义,而且在临床诊断、疾病预防、基因工程疫苗研究也具有重要意义。本研究以鸭肠炎病毒（DEV）C-KCE株基因组为模板,通过Tail-PCR的方法扩增了DEV C-KCE毒株未知的糖蛋白C（gC）基因及其两侧的序列,包括部分UL43同源序列、完整的UL44同源序列（gC基因）以及与UL45基因之间的部分非编码区,将其克隆到pMD18-T载体上,构建了pMD18-T-UL45-44和pMD18-T-UL44-43质粒,并进行了测序。DNA序列分析发现gC基因全长1296bp,编码431个氨基酸,有两个可能的启动子和poly（A）信号;部分UL43同源基因长600bp,编码200个氨基酸。对gC基因进行信号肽、糖基化位点（N-X-T/S）和跨膜区预测发现,gC基因的1-22位氨基酸为其信号肽区域;1-398位氨基酸位胞外区,399-421位氨基酸为跨膜区,422-431位氨基酸为胞质区;有四个潜在的糖基化位点。与12株已报道的具有完整gC （UL44）同源基因序列的疱疹病毒参考株进行比较,DEV C-KCE gC基因与α疱疹病毒gC同源基因有3个保守区域。系统进化分析DEV的gC基因,发现其与α-疱疹病毒亚科中禽的疱疹病毒亲缘关系较近。利用大肠杆菌表达系统pET30a（+）（E. coli Rosetta）,对不含信号肽部分的gC基因胞外区进行了原核表达,SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小为49kDa且具有较高的表达水平,目的蛋白（His-gC）占菌体蛋白的比例为30%。His-gC融合蛋白是以包涵体的形式存在的。Western-blotting分析表明所表达的蛋白具有良好的抗原性。经分离纯化融合蛋白His-gC,制备了抗DEV gC蛋白的兔抗血清,并进行了特异性鉴定,特异性良好。以生长在盖玻片上的CEF细胞中DEV病毒为抗原,以上述制备的兔抗DEV gC血清为一抗,进行间接免疫荧光染色,发现荧光主要集中于细胞膜和细胞质中。以兔抗DEV gC血清为中和抗体,进行蚀斑减数中和试验。结果显示,所制得的血清有中和活性,从而间接证明了糖蛋白gC上含有中和抗原表位。以表达的重组gC蛋白为刺激原,进行鸭淋巴细胞增殖试验,试验结果表明:gC蛋白具有刺激机体T细胞的增殖功能。采集刺激鸭的淋巴细胞上清,用USCN公司的鸭IFN-γ检测试剂盒检测其中的IFN-γ水平。结果表明,gC蛋白能刺激淋巴细胞产生IFN-γ,说明糖蛋白C能刺激机体的细胞免疫。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 鸭肠炎病毒（DEV）的特点、诊断及其防治的研究现状
• 1.1.1 DEV 的特性
• 1.1.2 鸭病毒性肠炎的诊断
• 1.1.3 鸭肠炎病毒的防治
• 1.2 α-疱疹病毒糖蛋白 C 的特点、功能及应用
• 1.2.1 α-疱疹病毒糖蛋白C 的特点
• 1.2.2 α-疱疹病毒糖蛋白C 的生物学功能
• 1.2.3 α-疱疹病毒糖蛋白C 的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 毒株、菌株、细胞和载体
• 2.1.3 常用生物学试剂
• 2.1.4 细胞培养用试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 鸭肠炎病毒GC 基因的克隆
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 DEV 基因组DNA 的提取
• 2.2.3 引物的设计与合成
• 2.2.4 Tail-PCR 扩增DEV 未知基因
• 2.2.5 PCR 产物的克隆和转化
• 2.2.6 重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定
• 2.2.7 序列测定
• 2.2.8 病毒基因ORF 预测和序列拼接
• 2.2.9 鸭肠炎病毒gC 基因及其编码蛋白的生物信息学分析
• 2.3 鸭肠炎病毒GC 蛋白的表达、鉴定和抗体的制备
• 2.3.1 表达引物的设计与合成
• 2.3.2 目的基因的获取
• 2.3.3 表达载体的构建及鉴定
• 2.3.4 目的基因的表达和纯化
• 2.3.5 表达条件优化
• 2.3.6 表达产物的Western blot 分析
• 2.3.7 兔抗重组gC 蛋白高免血清的制备及鉴定
• 2.4 鸭肠炎病毒GC 基因部分功能的研究
• 2.4.1 鸭肠炎病毒gC 基因定位的研究
• 2.4.2 鸭肠炎病毒gC 蛋白中和活性的鉴定
• 2.4.3 鸭肠炎病毒gC 蛋白刺激细胞免疫的检测
• 3 结果
• 3.1 鸭肠炎病毒GC 基因的克隆
• 3.1.1 鸭肠炎病毒gC 基因的扩增
• 3.1.2 重组克隆载体的鉴定
• 3.1.3 序列拼接及ORF 初步分析
• 3.1.4 鸭肠炎病毒gC 基因及其编码蛋白的生物信息学分析
• 3.2 鸭肠炎病毒GC 蛋白的表达、鉴定和抗体的制备
• 3.2.1 目的基因的获取
• 3.2.2 表达载体的构建及鉴定
• 3.2.3 目的基因的表达
• 3.2.4 表达条件优化
• 3.2.5 表达产物的Western blot 分析
• 3.2.6 原核表达目的蛋白的抗体的制备和鉴定
• 3.3 鸭肠炎病毒GC 基因部分功能的研究
• 3.3.1 鸭肠炎病毒gC 基因定位的研究
• 3.3.2 鸭肠炎病毒gC 蛋白中和活性的鉴定
• 3.3.3 鸭肠炎病毒gC 蛋白刺激细胞免疫的检测
• 4. 讨论
• 4.1 TAIL-PCR
• 4.2 糖蛋白GC 的分子特征
• 4.3 DEV GC 基因表达、纯化、鉴定及抗体的制备
• 4.4 鸭肠炎病毒GC 基因部分功能的研究
• 4.4.1 鸭肠炎病毒gC 基因定位的研究
• 4.4.2 鸭肠炎病毒gC 蛋白中和活性的鉴定
• 4.4.3 鸭肠炎病毒gC 蛋白刺激细胞免疫的检测
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文