染色质免疫沉淀技术筛选转录因子AP-2靶基因

论文摘要

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitationassay,简称ChIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。转录因子通过对细胞内外刺激作出反应调节基因的表达,它们常常通过控制基因转录的基本机制在决定细胞的命运中起主要的作用。转录因子AP-2就在许多参与哺乳动物发育、分化和癌症形成的基因转录调节中起到了重要的作用。为了鉴定AP-2转录因子所调节的下游靶基因,对与ChIP有关的实验条件进行了优化,获得了较优的实验条件,并运用ChIP实验在乳腺癌细胞系MDA-MB-453、宮颈癌细胞系HeLa和小鼠胚胎中来筛选和鉴定AP-2转录因子的结合位点。通过对这些AP-2-ChIP来源的DNA片段的细胞克隆和测序发现了新的AP-2转录因子的潜在的靶基因,这些靶基因在调节癌症的形成,细胞新陈代谢等方面起着相应的生物学功能。已有报道表明ErbB2基因是AP-2转录因子的下游靶基因,我们的实验结果与这一报道结果相一致。本研究运用ChIP实验筛选出了转录因子activator protein-2（AP-2）的下游靶基因,对于进一步研究AP-2的功能和调控网络打下了基础。

论文目录

• 专业名词缩写中英文对照简表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 染色质免疫沉淀技术简介
• 1.1 细胞的甲醛固定
• 1.2 超声波断裂染色质
• 1.3 氯化铯等密度离心纯化交联的染色质
• 1.4 染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化
• 1.5 交联反应的逆转和DNA的纯化
• 1.6 染色质免疫沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点鉴定
• 1.7 目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步验证
• 2 染色质免疫沉淀技术的应用
• 2.1 在组蛋白修饰的研究
• 2.2 在反式作用因子靶序列的研究
• 2.3 在RNA-蛋白质相互作用的研究
• 3 染色质免疫沉淀技术的前景展望
• 4 转录激活因子AP-2基因家族
• 4.1 转录激活因子AP-2基因家族的结构特点
• 4.2 转录激活因子AP-2基因家族的生物学功能
• 第一部分 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 仪器设备
• 1.2 试剂盒
• 1.3 载体和工具酶
• 1.4 抗体和蛋白
• 1.5 菌种,小鼠和细胞株
• 1.6 溶液配制
• 1.7 其它试剂
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 小鼠胚胎的获得
• 2.3 免疫沉淀和Western Blot检测
• 2.4 质粒pUC-19的处理
• 2.5 染色质免疫沉淀（ChIP）
• 2.6 pUC19-ChIP-DNA重组载体的构建
• 2.7 蓝白斑筛选、酶切和PCR验证和测序
• 2.8 RNA抽提和相对定量RT-PCR
• 2.9 生物信息学分析
• 第二部分 结果与分析
• 1 抗体的特异性检测
• 2 MDA-MB-453、HeLa和小鼠胚胎中AP-2蛋白检测
• 3 超声打断染色质的有效性检测
• 4 pUC-19载体酶切和去磷酸化效果的检测
• 5 pUC19-ChIP-DNA质粒的部分PCR和酶切
• 6 染色质免疫沉淀技术筛选AP-2靶基因
• 7 AP-2γ转录因子对候选靶基因的mRNA转录水平的影响
• 第三部分 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢