论文摘要
随着全球老龄化的到来，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者人群及相关的经济负担剧增，已经成为不容忽视的公共卫生事件。AD主要临床表现为渐行性、全面性认知功能减退，主要病理特征为脑内淀粉样蛋白β（AmyloidBeta，Aβ）的沉积及神经原纤维缠结。目前尚缺乏有效的治疗方法来阻止或逆转该病的进展。研究发现AD患者及AD高危人群的神经网络兴奋性明显增高。而来自不同研究团队的多项基础研究均提示，Aβ及其相关上游分子的异常表达能影响AD转基因动物模型的神经网络兴奋性，另一方面，异常的神经网络兴奋性可能导致Aβ相关的病理及认知损害。抗癫痫药物对神经网络兴奋性的调节作用已在多种不同疾病的动物模型中得到验证，包括AD、癫痫及衰老等。传统抗癫痫药物丙戊酸（Valproic acid，VPA）显著改善了AD转基因小鼠的病理与记忆损害，其机制除了对神经网络兴奋性的调节外，还与抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的活性有关。研究发现，常用的新型抗癫痫药物中，托吡酯（topiramate，TPM）与左乙拉西坦（Levetiracetam，LEV）均具有HDAC抑制作用。而目前关于新型抗癫痫药物TPM及LEV对AD转基因模型病理与行为的影响及分子机制研究较少。调节神经网络兴奋性与HDAC活性已成为AD治疗的新策略。既然新型抗癫痫药TPM及LEV能调节神经网络兴奋性与HDAC活性，那么我们提出以下两个问题：（1）新型抗癫痫药TPM及LEV能否改善AD转基因模型的病理与记忆损害？（2）新型抗癫痫药TPM及LEV对AD核心病理分子Aβ的清除及产生途径有何影响？其中的分子机制包括哪些？拟通过上述研究验证新型抗癫痫药TPM及LEV对AD转基因动物模型的保护作用，为AD的治疗策略拓宽思路。第一部分新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理学与行为学的影响目的：研究TPM与LEV对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理学与行为学的影响。方法与材料：选取7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠（体重约20-25克），分为阴性对照组（Ctrl）、TPM组、LEV组及阳性对照VPA组，每组10只；各组分别腹腔注射20mg/Kg TPM、50mg/Kg LEV、30mg/Kg VPA，阴性对照组注射同等体积的生理盐水，每日一次，持续30天。选用7月龄C57BL/6J小鼠作为非转基因对照。免疫组化技术（Aβ1-42）及硫磺素染色评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响，Western blotting评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内tau蛋白异常磷酸化的影响，Morris水迷宫实验评估抗癫痫药物对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆能力的影响。结果：与同龄野生型C57BL/6J小鼠相比，7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮质及海马区有大量Aβ沉积。在隐蔽平台实验中，其登台潜伏期、所游行的距离明显延长；在空间探索实验中，穿越原隐藏平台所在象限的次数明显减少。TPM、LEV显著减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积，降低tau蛋白异常磷酸化水平。在隐蔽平台实验中，TPM、LEV显著降低APPswe/PS1dE9双转基因小鼠登台潜伏期、所游行的距离；在空间探索实验中，TPM、LEV显著增加其穿越原平台所在象限的次数。结论：7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮层及海马区有大量Aβ沉积，存在tau蛋白异常磷酸化；同时，伴有明显的学习、记忆能力损害。新型抗癫痫药TPM、LEV能显著减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积及tau蛋白异常磷酸化，显著改善其学习、记忆能力。第二部分新型抗癫痫药托吡酯与左乙拉西坦对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制目的：研究TPM与LEV对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ清除与产生途径的影响及分子机制。方法与材料：选取7月龄的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠（体重约20-25克），按分组分别腹腔注射20mg/Kg TPM、50mg/Kg LEV、30mg/Kg VPA，阴性对照组腹腔注射同等体积的生理盐水，每日一次，持续30天。体外研究中，选择人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y作为研究对象，分为阴性对照组（Ctrl）、TPM组（0.25mM）、LEV（0.25mM）及阳性对照VPA（1.0mM）。ELISA检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及外周血Aβ1-42浓度，Western blotting检测各组脑组织中低密度脂蛋白受体相关蛋白1（Low density lipoproteinreceptor-related protein1，LRP1）、晚期糖基化终产物受体（receptor for advancedglycosylation end products， RAGE）的表达； Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein light chain3，LC3）、Beclin1的表达；Westernblotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、β位淀粉样前体蛋白裂解酶1（beta-site APP cleaving enzyme1，BACE1）、淀粉样前体蛋白羧基末端片段（amyloid precursor protein carboxy terminal fragments，APP-CTFs）的表达；Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、AMP激活的蛋白激酶α （AMP-activated proteinkinase，AMPKα）磷酸化（p-GSK-3β（Ser9）、p-Ak（tSer473）、p-AMPKα（Ser172））的表达；Western blotting检测各组APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株中组蛋白H4乙酰化（acetylated histone H4，Acetyl-H4（Lys5））的表达。结果：TPM、LEV显著降低APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织Aβ1-42的浓度，增加外周血Aβ1-42的浓度，同时，上调脑组织中LRP1的表达；TPM、LEV显著上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株LC3、Beclin1的表达；TPM、LEV显著上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株p-GSK-3β（Ser9）、p-Akt（Ser473）、p-AMPKα（Ser172）的表达；TPM、LEV显著上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑组织及SH-SY5Y细胞株Acetyl-H4（Lys5）的表达。结论：新型抗癫痫药TPM、LEV显著减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积的机制可能包括：（1）促进血脑屏障转运Aβ的能力及自噬；（2）抑制γ分泌酶的活性减少Aβ的产生。TPM、LEV促进自噬及抑制γ分泌酶可能通过调控Akt与AMPKα的磷酸化而抑制GSK-3β的活性。TPM、LEV可能抑制了APPswe/PS1dE9双转基因鼠HDAC的活性。综上所述，本研究的主要创新之处在于：1.新型抗癫痫药TPM、LEV显著改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠神经病理及学习记忆能力损害新型抗癫痫药TPM、LEV能显著减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内Aβ沉积及tau蛋白异常磷酸化，显著改善其学习、记忆能力。该结果为AD发病机制的“神经网络兴奋性异常”假说提供依据，提示“异常的神经网络兴奋性”可能为AD药物研发的潜在靶点。2.新型抗癫痫药TPM、LEV调节Aβ清除及产生途径新型抗癫痫药TPM、LEV能促进血脑屏障转运Aβ的能力及自噬，抑制γ分泌酶的活性减少Aβ的产生；分子机制可能与其抑制HDAC活性及抑制GSK3β活性有关。该结果提示HDAC为干预AD的潜在靶点。