论文摘要
背景和目的血管内皮炎症已被证实与许多心血管疾病,如动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、高血压等的发生、发展及预后密切相关。如能无创性地对“血管炎症”进行靶向分子成像,无疑可为临床早期诊断心血管疾病提供非常有价值的手段,进一步指导早期的干预、治疗。因此,现有的许多无创性影像技术,如：超声、MRI、CT、SPECT等均在对“血管炎症”的靶向分子成像进行积极探索。靶向超声分子成像作为近年兴起的一门无创性分子影像技术,是通过在超声微泡表面连接特异性配体构建靶向微泡,以靶向微泡作为示踪剂,经静脉注入后与血管内皮细胞表面特异性靶向分子有效结合,再通过对局部靶向粘附的微泡行超声对比成像,特异性评价血管内皮细胞上分子学变化,从而实现疾病分子水平上特异诊断的目的。与其他依靠解剖结构和组织生理学改变来发现和诊断疾病的传统影像学技术相比较,超声分子成像技术具有实时、高空间、时间分辨率,无放射污染,仪器便携、价廉等先进性。许多研究表明,血管内皮细胞功能异常作为血管炎症反应过程必要的参与因素,是以内皮细胞表面P-（platelet-selectin）、E-（endothelial-selectin）和L-（leukocytes-selectin）选择素,血管粘附分子VCAM-1 （vascular adhesionmolecule-1）和细胞间粘附因子ICAM-I （intracellular adhesion molecule-1）等的明显上调为特征的。这些粘附因子介导炎症细胞实现在血管内皮表面滚动、牢固结合及向内皮下迁移,其表达往往具有区域特异性和特异疾病关联性。若能实现对这些异常表达粘附因子的靶向检测,有望在早期评价血管炎症反应和相关疾病。而超声分子影像技术可通过在超声微泡表面连接与内皮特异因子靶向结合的配体,介导微泡与靶分子有效结合,再行对比超声成像,具有对“血管炎症”进行靶向分子成像的潜能。毫无疑问,靶向超声微泡与血管内皮表面靶分子的有效结合是实现超声分子成像的核心和关键,而靶向微泡表面配体的选择对其粘附效能具有重要的影响。目前常用的靶向超声微泡主要是通过主动性靶向机制,采用具有脂质外壳含惰性气体的微泡在其表面上装配特异性配体来实现。抗体、多肽和多糖等多种分子物质均可作为配体与超声微泡连接构建成特异的靶向性超声微泡。国内外已有许多研究通过在微泡表面携带与血管粘附因子特异性结合的单克隆抗体构建靶向超声微泡,成功实现了对血栓、心脏缺血再灌注等血管炎症相关性疾病的超声分子影像评价。但是,由于大部分抗体与靶分子的结合和解离速率低、作用过程相对缓慢,形成牢固结合需要一定的接触时间,而血流速度快、剪切应力大,微泡与靶分子的接触时间短暂,在尚未形成牢固结合前可被血流冲刷脱离而难以达到高效结合,这使得应用携带单一抗体的靶向超声微泡目前仅能对血流速度慢、剪切应力小的静脉系统疾病进行良好靶向超声分子影像评价,严重限制了靶向超声分子成像技术在动脉系统中的应用,而大多数与心血管疾病相关的病理过程都发生在动脉中。因此,要实现超声微泡在动脉系统有效的靶向结合需要微泡在高剪切应力下具有与靶分子快速粘附和牢固结合的特点。若能利用具有靶向诱导作用的“双配体”连接技术,设计在同一超声微泡上连接两种配体,一种是可与靶分子快速结合的配体,另一种是可与靶分子稳定结合的配体,有望实现高剪切应力下微泡的有效靶向结合。近期发现一种非抗体型的配基Sialyl Lewisx能与选择素快速但不十分牢固地结合,于炎症早期介导白细胞在血管内皮表面滚动,它可以为某些缓慢结合型配基形成牢固结合提供机会。因此,本实验通过构建同时携Sialyl Lewis"（?）和P-选择素单抗的双配体靶向超声微泡,利用平行板流动腔评价其在高剪切应力下的靶向黏附行为特征和粘附效能,并在小鼠腹主动脉炎症模型上,结合对比超声评价其分子成像效果,探讨具有靶向诱导作用特点的“双配体”能否介导靶向微泡实现从滚动到牢固黏附的高效结合,为发展在高剪切应力下具有更好黏附效能的靶向超声微泡构建技术,进而开拓超声分子影像技术在评价动脉炎症反应中的应用领域提供可行性指导。方法1、生物素化脂质超声微泡的制备：将各种脂质材料及辅助材料（DSPE-PEG2000-Biotin、DPPC、PEG4000等）按一定比例加入适量蒸馏水中水浴溶解后,通入全氟丙烷（C3F8）气体,剪切仪高速剪切至形成乳白色液体制备生物素化脂质微泡,静置、洗涤、纯化3次后,显微镜下观察并利用库尔特计数仪检测其大小及浓度。2、靶向超声微泡的制备：生物素化的脂质超声微泡制备后,加入一定量的抗生蛋白链菌素,静置后洗涤、纯化3次,分别按1×107个微泡1.5μg、7.5μg和7.5μg比例依次加入Sialyl Lewisx、P-选择素单抗、同型对照单抗制备分别携Sialyl lewis" （Selectin-targeted microbubbles, MBs）、P-选择素单抗（P-selectin-targeted microbubbles, MBp）和同型对照单抗（isotype control microbubbles, MBC）三种靶向超声微泡,并按1×107个微泡加入0.75μg Sialyl Lewisx和3.75μg P-选择素单抗比例同时加入两种配体制备出携Sialyl Lewisx和P-选择素单抗的双配体靶向超声微泡（Dual-liglands microbubbles, MBD）,每种微泡制备后静置、洗涤、纯化3次,经库尔特计数仪检测其大小及浓度。3、靶向超声微泡的体外鉴定：每种靶向微泡均取5×106个稀释至1ml,与Sialyl Lewisx抗体（CD15s）作用后,同时与FITC（绿色）标记的抗大鼠二抗和TRITC（红色）标记的抗小鼠二抗孵化,洗涤、纯化后连续于显微镜常光、红色和绿色光谱的光照作用下观察拍照；并以MBc作对照,用流式细胞仪检测MBs、MBP和MBD的配体结合率。4、平行板流动腔法体外评价超声微泡的靶向粘附性能：配备浓度为1μg/ml的小鼠P-选择素Fc段溶液,按200μl/个滴加在每个培养皿中央进行包被。4.1、结合实验：利用平行板流动腔分别设定0.5、2.0和4.0 dyn/cm2三种剪切应力。同一剪切应力下,每种微泡（约5×106个/ml）分别经微量注射泵作用通过平行板流动腔,显微镜下录像观察6分钟。4.2、解离实验：每种微泡（约5×106个/ml）取1ml,分别注入平行板流动腔培养皿后静置5分钟,先以0.9%生理盐水以0.2 dyn/cm2剪切力冲洗掉静止但未结合的微泡,至镜下无游离的微泡后,每30秒增加一次剪切应力,至镜下微泡完全解离。4.3、利用image-pro-plus图像分析软件,分析每种剪切引力下瞬时滚动的微泡数目、6分钟时视野内牢固结合的微泡数目和解离实验中每次剪切应力增加后30秒视野内仍牢固结合的微泡数目。5、小鼠腹主动脉炎症模型的制备：12只小鼠随机平均分为炎症组和对照组,炎症组小鼠在肾动脉分支至髂动脉分叉之间的腹主动脉周围注入含0.5μgTNF-a和0.125μg IL-1β的0.3 ml PBS溶液,对照组小鼠只注入0.3 ml PBS溶液,回置肠腔,缝合切口关闭腹腔作用4小时。6、靶向超声分子成像：制备的小鼠采用经尾静脉随机注射MBC、MBS、MBP和MBD（5×107个）（两次注射间隔30分钟）,6分钟后行对比超声检查观察腹主动脉的显影情况,并采用MCE软件对所得图像进行分析,测量小鼠腹主动脉造影声强度（video intensity,Ⅵ）,编辑主动脉显影的彩色编码图像。7、病理组织和免疫组化染色检查：超声分子成像结束后,立即处死小鼠取腹主动脉分别行HE染色和免疫组化染色。结果1、靶向微泡的制备：显微镜下观察MBC、MBS、MBP和MBD均为分布均匀,大小均一的透亮气泡,应用库尔特计数仪测得四种微泡的平均粒径分布为（2.182-2.378）μm,平均浓度分布为（1.239-1.341）×108个/ml,四种微泡平均粒径比较（F=0.874,P=0.494）和平均浓度比较（F=0.047,P=0.985）均无显著差异。2、靶向微泡的体外鉴定：每种微泡均采用FITC标记的羊抗大鼠二抗和TRITC标记的羊抗小鼠二抗孵化并洗涤纯化后,在荧光显微镜下观察示,MBc未呈现荧光,MBs只有明显的红色荧光,MBP只呈明显的绿色荧光,而MBD在对应光照作用下分别呈现均匀明显的红色和绿色荧光；以MBc作为对照,经流式细胞仪测得,MBS、MBP和MBD的配体结合率均在80%以上,三者比较无显著差异（F=1.773,P=0.248）。以上均表明利用“生物素-亲和素”桥接技术可使配体与脂质微泡有效连接,成功构建双配体靶向微泡和其他同型对照微泡。3、平行板流动腔法评价微泡的靶向粘附性能3.1、结合实验显示：将MBC、MBS、MBP和MBD分别在0.5、2.0和4.0 dyn/cm2剪切应力下通过表面包被相同浓度小鼠P-选择素Fc段溶液的平行板流动腔时,可观察到除MBc少量滚动和粘附外,MBS、MBP和MBD的滚动和结合数目均较多。在相同剪切应力下,MBS、MBP和MBD的瞬时滚动数目和全程（6分钟）结合数目均明显高于MBC （P<0.01）。MBC的瞬时滚动数目在不同剪切应力下无显著差异（F=4.287,P=0.070）,全程结合数目在4.0 dyn/cm2时均较0.5和2.0dyn/cm2时减少（F=6.833,P=0.028）；而MBS、MBP和MBD的瞬时滚动数目和全程结合数目均随剪切应力的提高而减少（P<0.05）。其中,在剪切应力为0.5dyn/cm2时示：MBS、MBP和MBD的瞬时滚动数目比较和全程结合数目比较均无显著差异（P>0.05）；在2.0dyn/cm2时示：MBs和MBD的瞬时滚动数目均高于MBP （MBS较MBP：P=0.047；MBD较MBP:P=0.002）,而前两者比较无显著差异（P=0.262）；全程结合数目由少至多依次为MBP、MBS和MBD （P<0.05）。在4.0 dyn/cm2时示：MBs和MBD的瞬时滚动数目均高于MBP （MBS较MBP:P=0.003；MBD较MBP：P-0.015）,而前两者比较无显著差异（P=1.000）；MBD的全程结合数均明显高于MBs和MBP （MBD较MBS:P=0.018; MBD较MBP：P=0.001）,后两者比较无显著差异（P0.455）。以上表明在平行板流动腔中,MBS、MBP和MBD均可抵抗一定剪切应力流体的冲刷,对P-选择素实现靶向结合,且MBD在较高剪切应力下显示出优于MBs和MBP的靶向结合效能。3.2、解离实验显示：在包被相同P-选择素浓度的平行板流动腔内注入1 ml的微泡后,静置5分钟待其与靶分子靶向结合后,每30秒增加一次剪切应力,常光显微镜下观察可见,MBC、MBS、MBP（?）和MBD仍结合于平行板流动腔表面的数目随着剪切应力的增加而减少；其中,MBC不能与P-选择素稳定结合,在较低剪切应力下即可见明显的解离,MBS、MBP和MBD的结合相对稳定,能抵挡一定剪切应力的冲刷作用。图像定量分析后显示：MBC、MBS、MBD和MBP的半数解离剪切应力依次增高,分别为（4.133±0.83）、（10.20±0.87）、（19.20±1.4）和（29.40±3.54） dyn/cm2 （F=91.374,P=0.000）。仅在（14.20±2.82）dyn/cm2时MBC就达到完全解离,而MBS、MBD和MBP的完全解离剪切应力依次为（29.40±4.26）（67.06±5.46）和（101.80±3.54）dyn/cm2,三者比较依次增高（F-271.389,P=0.000）。表明靶向微泡与靶分子结合后能够抵挡一定剪切应力的冲刷,其中MBs为不稳定结合,MBD结合相对牢固,而MBP一旦结合就十分牢固,能够抵挡高剪切应力的冲刷。4、靶向超声分子成像：分别随机经尾静脉注射MBC、MBS、MBP和MBD 6分钟后,在对照组小鼠腹主动脉中均未见明显的超声显影,在炎症组小鼠腹主动脉中除MBC无明显超声显影外,MBS、MBP和MBD可呈现不同程度相对明显的超声显影,其中MBD的显影较MBs和MBP明显增强。5、超声图像定量分析：对采集的超声图像进行Ⅵ定量分析后显示,除MBC外（t=0.099,p=0.923）,MBS、MBP和MBD在炎症组小鼠中腹主动脉中的Ⅵ值均高于对照组（MBS:t=9.363, p=0.000; MBP:t=6.841, p=0.000; MBD:t=8.246,p=0.000）。其中,在对照组中,MBc、MBS、MBP和MBD的Ⅵ值无显著差异（F=1.199,P=0.336）；而在炎症组中,MBS、MBP和MBD的Ⅵ值均明显高于MBC（F=36.349,P-0.000）,且MBD较MBS、MBP显著增加（P<0.05）,后两者间无显著差异（P>0.05）。6、病理组织和免疫组化染色结果6.1、HE染色显示：对照组小鼠腹主动脉无明显病理改变,中外膜结构清晰,内皮扁平光滑；炎症组小鼠腹主动脉壁水肿增厚,内皮皱缩凸向管腔,管腔狭窄,中膜可见平滑肌细胞增生、排列紊乱,部分迁入内膜下,弹性蛋白收缩明显,增生断裂、散落在外膜内。6.2、免疫组化染色显示：对照组小鼠腹主动脉内皮P-选择素表达均为阴性,而炎症组小鼠腹主动脉内皮均可见P-选择素表达,表明小鼠腹主动脉炎症模型构建成功。结论1、采用“生物素-亲和素”桥接技术可实现Sialyl Lewisx和P-选择素单抗与脂质微泡外壳的有效连接,成功构建携Sialyl Lewisx和P-选择素单抗的双配体靶向超声微泡和同型对照单配体靶向超声微泡。2、MBS、MBP和MBD在体外均能与P-选择素靶向结合,且显现出不同的靶向黏附行为方式和粘附效能。其中,MBs呈高效滚动后的不稳定黏附,MBP表现为低效滚动后的牢固结合,而MBD能够实现高效滚动后相对牢固的结合。在较高剪切应力下MBD对P-选择素的靶向粘附效能明显优于MBP和MBs。3、结合对比超声行小鼠腹主动脉炎症反应分子成像评价,MBD的靶向成像效果优于MBs和MBP。
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