SeNHX1转入洋桔梗的耐盐初步研究

论文摘要

高盐是限制作物生长、发育和产量的主要胁迫之一。当前,全球人口不断增加,20%的灌溉农业遭受盐胁迫,培育高抗盐的植物新品种,开发利用盐碱地,已经成为一个亟待解决的全球性问题。近几年,分子生物学发展迅速,转基因技术已逐渐替代传统育种技术,成为耐盐领域研究的焦点。随着植物耐盐机制的深入研究,大量的耐盐相关基因被成功分离与表达,一系列转基因的高抗盐植株被相继报道。本实验通过农杆菌介导法将液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因（SeNHX1）转入洋桔梗,以获得高耐盐的抗性植株。其中,目的基因SeNHX1来源于世界上最耐盐的植物之一盐角草,将其插入带有双35S启动子和增强子的高效表达载体pBin438,构建双元表达载体pBin438-SeNHX1。转化受体洋桔梗为全球七大切花之一,洋桔梗在再生体系与转基因方面已有相关报道,本研究在原有体系的基础上,进一步优化了洋桔梗的叶片再生体系,农杆菌遗传转化体系,获得叶片分化培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L愈伤组织分化率达70%;苗伸长培养基MS+GA30.8+NAA0.1+IAA0.2;生根培养1/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L,生根率达42%;最优的转化条件为菌液浓度为OD600值0.6,浸染20分钟,共培养3天,AS浓度100μmol/L,Cef浓度300mg/L,Kan浓度40mg/L。通过Kan和NaCl的逐步筛选得到32株抗性苗,对部分植株进行分子检测,初步证明目的基因已整合到洋桔梗的基因组中。200mmol/L盐胁迫下,叶绿素、脯氨酸含量等抗盐生理指标的检测,同样证明了转基因植株较高的耐盐性状。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 盐胁迫对植物的危害
• 1.2 植物的耐盐机制
• 1.2.1 渗透调节
• 1.2.2 大分子蛋白类调节
• 1.2.3 细胞内的离子平衡调节
• 1.2.4 生物酶保护系统
• 1.2.5 代谢途径的改变
• 1.2.6 激素调节
• +/H⁺逆向转运蛋白的研究进展'>1.3 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的研究进展
• +/H⁺逆向转运蛋白的发现及基因分离'>1.3.1 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的发现及基因分离
• +/H⁺逆向转运蛋白的结构研究'>1.3.2 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的结构研究
• +/H⁺逆向转运蛋白的功能研究'>1.3.3 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的功能研究
• +/H⁺逆向转运蛋白的表达调控'>1.3.4 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的表达调控
• +/H⁺逆向转运蛋白的基因工程研究'>1.3.5 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因工程研究
• 1.4 洋桔梗的研究进展
• 1.4.1 洋桔梗的基本特征及市场前景
• 1.4.2 洋桔梗组织培养研究进展
• 1.4.3 洋桔梗基因工程研究进展
• 1.5 实验的目的、意义及技术路线
• 1.5.1 实验的目的与意义
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 洋桔梗高频再生体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 培养条件
• 2.1.3 主要仪器及试剂
• 2.1.4 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同激素配比对叶芽分化的影响
• 2.2.2 激素浓度对不定芽生长的影响
• 2.2.3 生长素对试管苗生根的影响
• 2.2.4 试管苗的移栽
• 2.3 讨论
• 第三章 pBin438-SeNHX1双元表达载体的构建
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 含有目的基因质粒的提取
• 3.2.2 目的基因SeNHX1 的扩增
• 3.2.3 PCR 产物回收与纯化
• 3.2.4 PCR 产物与T 载体的重组
• 3.2.5 大肠杆菌感受态的制备
• 3.2.6 大肠杆菌转化
• 3.2.7 重组载体的鉴定
• 3.2.8 pBin438-SeNHX1 载体的构建
• 3.2.9 农杆菌C58 感受态细胞的制备
• 3.2.10 农杆菌C58 的电击转化
• 3.2.11 阳性转化菌株的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 SeNHX1 基因的PCR 扩增
• 3.3.2 重组T 载体的鉴定
• 3.3.3 表达载体pBin438-SeNHX1 的鉴定
• 3.3.4 农杆菌转化子的鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 农杆菌介导的洋桔梗转化条件的优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料与转化受体
• 4.1.2 质粒和菌种
• 4.1.3 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 卡那霉素（Kan）适宜筛选压力的确定
• 4.2.2 头孢霉素（Cef）浓度的确定
• 4.2.3 NaCl 胁迫压力的确定
• 4.2.4 转化条件的优化
• 4.2.5 农杆菌介导的遗传转化程序
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Kan 筛选压力的确定
• 4.3.2 Cef 浓度的确定
• 4.3.3 洋桔梗对NaCl 的天然抗性
• 4.3.4 转化条件的优化
• 4.4 讨论
• 4.4.1 Kan 的筛选临界浓度
• 4.4.2 Cef 抑菌抗生素浓度的选择
• 4.4.3 农杆菌浓度及浸染时间
• 4.4.4 共培养时间
• 4.4.5 AS 浓度
• 4.4.6 外植体材料的生理状态对转化效率的影响
• 第五章 阳性植株的筛选与检测
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 仪器设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 Kan 抗性筛选
• 5.2.2 NaCl 抗性筛选
• 5.2.3 分子水平的检测
• 5.2.4 叶绿素含量的测定
• 5.2.5 游离脯氨酸含量的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 Kan 的抗性表型
• 5.3.2 NaCl 的抗性表型
• 5.3.3 PCR 分子检测
• 5.3.4 叶绿素含量的测定
• 5.3.5 脯氨酸含量的测定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 抗生素筛选
• 5.4.2 NaCl 抗性筛选
• 5.4.3 分子水平的检测
• 5.4.4 叶绿素含量变化
• 5.4.5 脯氨酸含量变化
• 第六章 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢