论文摘要
目的探讨在老年骨再生功能低下时应用膜引导结合Adv-BMP-2局部基因治疗对骨缺损修复的促进作用,以寻找治疗老年性骨缺损的有效方法。1.成骨细胞的提取、体外培养和鉴定;Adv-BMP-2的扩增、纯化、滴度测定;Adv-BMP-2对成骨细胞生物学行为的影响。2.TNF-α对于成骨细胞生长的影响和对BMP受体表达的调控作用。3.手术建立大鼠去势后骨质疏松牙槽骨缺损动物模型,为进一步的动物实验奠定基础。4.应用体外法（ex vivo）进行BMP-2基因转移,研究Adv-BMP-2对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复的成骨效果。5.异体冷冻骨膜与e-PTFE膜复合红骨髓对颌骨缺损成骨性能的比较分析。6.通过老年大鼠骨质疏松骨缺损动物模型,采用体内法（in vivo）进行BMP-2基因转移结合膜引导修复老年性骨缺损并与其他不同植骨材料进行比较,以寻找治疗老年性骨缺损的有效方法。方法1.成骨细胞的提取、体外培养和鉴定。原代成骨细胞来自出生1周Wistar乳鼠,进行成骨细胞培养,通过形态学观察、ALP染色、体外矿化实验,鉴定成骨细胞是否培养成功。Adv-BMP-2的扩增、纯化、滴度测定。观察成骨细胞转染Adv-BMP-2后生物学行为的变化。2.采用MTT及PNPP法检测不同浓度TNF-α对于成骨细胞增殖和分化的影响。在保证细胞量相等的前提下,利用RT-PCR技术测定不同浓度TNF-α对于成骨细胞BMP受体表达的调控作用。3.建立大鼠骨质疏松牙槽骨缺损动物模型并通过各种检测方法证实模型建立。40只3月龄雌性大鼠随机分为4组,A组:S0组;B组:0VX组;C组:BD组;D组:0VX+BD组。术后8周、12周测定大鼠体重变化;血清中ALP、Ca、P含量及子宫重量系数变化;用双能X线吸收法（DEXA）行颌骨密度和骨矿含量测定。4.20只健康雌性Wistar大鼠,随机分为2组。实验组:A组为Adv-BMP-2转染成骨细胞/CS组（A/C组）;对照组:B组为去势牙槽骨缺损对照组（OB组）。分别在第8周、第12周处死动物,获取标本并行大体观察、X线检查、组织学检查。5.将健康Wistar大鼠断颈法处死后取颅骨顶骨骨膜制备异体冷冻骨膜（variant deepfreeze periosteum,VDP）备用。24只成年Wistar大鼠随机分为3组。于下颌骨升支部制造约0.5cm×0.5cm的骨缺损。A组:SO组:B组:e-PTFE/RBM组;C组:VDP/RBM组。分别在第4周、第8周处死动物,获取标本行大体观察、X线检查、组织学检查。观察不同膜引导成骨性能的效果。6.40只雌性,老年Wistar大鼠22月龄（体重330±32g）,SPF级（无特定病原体动物）,随机将40只Wistar大鼠分为ABCDE五组:A组为SO组;B组为VDP/Adv-BMP-2/CS组;C组为VDP/Perioglas组;D组为VDP/HPPA组;E组为VDP/Adv- GFP/CS组。于下颌骨升支部制造约0.5cm×0.5cm的的全厚下颌骨缺损模型,BCD实验各组分别植入不同材料。A组为对照组未植入任何材料,作为空白对照。分别于术后第8周、第12周处死动物。获取标本并行大体观察、X线检查、组织学检查、免疫组化检查。E组行体内绿色荧光蛋白成骨示踪,观察各组不同时期的新生骨量并进行统计学比较。结果1.成骨细胞体外培养形态观察:成骨细胞初期为多角形,胞核呈椭圆形;培养1周,细胞为近立方状,体积小、核圆。碱性磷酸酶（ALP）活性检测:ALP活性是成骨细胞分化成熟的重要标志之一。体外培养扩增的细胞ALP染色和钙化实验均为阳性,证实培养的细胞具有典型的成熟成骨细胞的特征。Adv-BMP-2转染后可提高成骨细胞增殖功能和分化功能。2.本结果显示当TNF-α浓度大于50ng/ml时对于成骨细胞增殖就有明显的抑制作用。当TNF-α的浓度大于5ng/ml时对于成骨细胞分化有明显抑制作用。不同浓度TNF-α均可以抑制BMP-IA和BMPR-Ⅱ基因的表达,但对BMP-IB却有促进作用。3.通过手术建立动物模型并进行各种指标监测显示,手术后12周已成功地制备了大鼠骨质疏松牙槽骨缺损动物模型。为进一步的动物实验奠定了基础。4.应用体外法（ex vivo）进行BMP-2基因转移,并进行大体观察、X线检查和组织学检查后发现:Adv-BMP-2对于骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复有明显的促进作用。5.VDP及e-PTFE不同引导膜修复大鼠下颌骨缺损并与空白对照组比较。术后8周结果显示:VDP及e-PTFE膜组都有新骨形成并遍布整个骨缺损区。而对照组显示:除边缘有少量骨组织外骨缺损区充满纤维结缔组织。VDP及e-PTFE膜都可引导骨缺损形成骨组织。6.采用体内法（in vivo）进行BMP-2基因转移结合膜引导修复老年性骨缺损并与其他不同植骨材料进行比较。结果发现不同种类的生物材料直接影响界面区早期的组织反应,膜引导结合Adv-BMP-2比其它材料较早地引导了新骨形成。6.1.X线观察:术后8周对照A组骨缺损区界线清楚,缺损边缘可见少量高密度影。实验B组、C组、D组骨缺损区域均有呈絮状或云雾状密度增高影,材料与骨界限清楚,各组差异不明显。术后12周:对照组仍有约2mm左右的骨缺损。B组缺损修复区骨密度最高,新生骨组织覆盖缺损,缺损处密度与周围骨质基本相似,交界已模糊不清。C组、D组缺损也己完全修复,交界线也模糊不清,但缺损处密度略低于周围骨组织。6.2.组织学观察:术后8周对照A组骨缺损区周边可见成骨细胞及少量成骨,骨缺损中心区可见大量纤维结缔组织形成。实验B组、C组、D组有不同程度成骨。B组移植骨周边诱导骨明显增加,成骨细胞增生活跃;新骨自四周向中心堆积,钙盐沉积增多。C组可见部分区域Perioglas白色透明颗粒样成骨材料基本溶解,周围留下一些颗粒溶解的空腔,在其周围形成许多基骨。仅少部分材料周围有薄层的结缔组织,在颗粒间隙可见有明显的骨母细胞、骨细胞、骨样组织。D组所有材料周围均有大量类骨质生成,但类骨质的钙化程度以及基质中细胞形态都有差异。材料已牢固地与骨组织连成一片,新骨组织包绕材料,新生骨改建明显。术后12周对照A组骨缺损区边缘有少量新骨沉积,腔内被纤维组织充满。成骨细胞和类骨质仍局限在两端,缺损中央被纤维结缔组织充填,血管少,未见成骨现象。B组缺损处几乎被新生骨组织充填,仅存少许纤维组织,周边可见骨小梁形成。C组白骨缺损中心到边缘区域的新生骨均由骨桥连结起来,Perioglas降解后留下的空腔已完全被新生骨取代。骨缺损部位骨样组织、骨组织进一步增多。D组HPPA植入后材料基本由骨组织覆盖,新骨形成明显,钙化程度高,晶界模糊。6.3.统计分析结果:术后8周B组优于C组（P＜0.05）和D组（P＜0.05）;C组与D组两组差异无显著性意义（P＞0.05）。术后12周B组、C组、D组明显优于A组（P＜0.01）。6.4.大鼠体内绿色荧光蛋白成骨示踪:E组移植术后2周冰冻切片和连续石蜡切片,在荧光显微镜下观察,均可见移植部位呈发射绿色荧光的网状支架材料并可见成骨细胞。移植后4周冰冻切片和连续石蜡切片,在荧光显微镜下观察,仍可见移植部位呈发射绿色荧光的网状支架材料及成骨细胞。结论1.体外实验证实:Adv-BMP2对成骨细胞增殖功能和分化功能有明显促进作用。为后续BMP-2基因治疗的应用研究奠定了基础。2.当TNF-α浓度大于50ng/ml时对于成骨细胞增殖就有明显的抑制作用。当TNF-α的浓度大于5ng/ml时对于成骨细胞分化有明显抑制作用。不同浓度TNF-α均可以抑制BMP-IA和BMPR-Ⅱ基因的表达,但对BMP-IB却有促进作用。总体说来,TNF-α对于BMPR复合体起抑制作用。3.可以手术制备大鼠骨质疏松牙槽骨缺损动物模型,为进一步的动物实验奠定基础。4.体外法（ex vivo）进行BMP-2基因转移修复骨质疏松牙槽骨缺损,Adv-BMP-2对于骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复有明显的促进作用。5.VDP及e-PTFE不同引导膜都可引导大鼠颌骨缺损骨组织修复。6.体内法（in vivo）进行BMP-2基因转移结合膜引导修复老年大鼠骨缺损比其它材料较早地引导了新骨形成,是一种理想的骨组织替代材料。特别是对老年骨再生能力低下骨缺损的修复有明显的促进作用。