论文摘要
研究背景动脉粥样硬化性疾病的发病率呈明显的增长趋势,给人类的健康带来严重的威胁。动脉粥样硬化进程的特点是单核细胞和淋巴细胞被招募到血管内膜,随后诱导血管中层血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）向内膜迁移并增殖,引起血管腔狭窄导致病变发展。近年来,冠脉介入治疗临床应用给冠心病患者带来了福音,但术后再狭窄也严重影响着冠脉介入治疗的远期效果,研究证实VSMCs过度增殖是导致冠脉介入术后再狭窄的主要原因。由此看出:VSMCs过度增殖在动脉粥样硬化和冠脉介入术后再狭窄中都有着重要的作用,然而起增殖的内在机制目前尚未完全阐明。基础研究表明Ca2+是调节细胞增殖的重要物质基础,去除细胞外钙后细胞增殖被明显抑制。VSMCs胞内Ca2+的调节依赖于Ca2+跨膜转运与细胞内钙库释放和再摄取Ca2+等过程。在VSMCs胞膜上有两种钙内流:1、由电压门控钙通道介导的钙内流,电压门控钙通道介导的钙内流可以引起VSMCs中Ca2+浓度的迅速增加,从而引起VSMCs的收缩;2、由钙库操纵型钙通道（SOC）介导的钙库Ca2+释放激活的Ca2+内流（CRAC）。研究表明在VSMCs在疾病状态下发生表型转换后,电压门控钙通道相关蛋白的表达逐渐下调。那么在这种状态下,是什么Ca2+通道介导细胞的Ca2+内流?近年来研究证明由SOC引发的胞浆内Ca2+浓度持续缓慢上升是细胞增殖的关键因素,在VSMCs上也发现了SOC通道的存在。SOC激活机制是:外来刺激通过IP3和兰尼定受体途径引发细胞内钙库中Ca2+的释放,当胞内钙库中Ca2+的浓度下降到一定程度时,细胞膜上SOC开放产生CRAC,引起细胞内Ca2+浓度持续缓慢上升,从而补充胞浆和钙库中的Ca2+,维持细胞的兴奋性,CRAC是SOC介导的典型Ca2+内流。目前细胞生物学的研究确定STIM1（stromal interaction molecule 1）是侦测胞内钙库中Ca2+下降从而导致细胞膜CRAC形成的分子。STIM1在多种细胞中表达（包括VSMCs）。Putney等用RNAi技术抑制了STIM1表达后,全细胞电位箝制法也无法测得胞膜上CRAC的形成。STIM1基因位于人的11号染色体上,蛋白分子位于内质网。在此,本研究证明STIM1分子可能在血管平滑肌细胞增殖中有着重要的作用,可能是抑制血管平滑肌细胞增殖新的药物靶点。实验方法1、大鼠siRNA靶序列的设计根据文献报道选取2条25nt的序列（rSTIM1, GenBank NO:NM001108496）,即STIM11:GCAUGGAAGGCAUCAGAAGUGUAUA;STIM12:GGAUGAGGUGAUACAGUGGCUGAUU,在引物设计时两端分别加入BamHI和HindIII酶切位点。稀释退火片段分别与线性化PEGFP6-1、PEGFP6-4载体的连接:STIM11稀释退火片段与PEGFP6-1载体的连接为STIM11-22;STIM12稀释退火片段与PEGFP6-4载体的连接为STIM12-4。质粒STIM11-22、STIM12-4的SalI+PstI双酶切分别回收大片段和小片段:STIM11-22回收大片段与STIM12-4回收小片段的连接,筛选后鉴定,将其连接到穿梭质粒PGSadeno,包装重组腺病毒,命名为Ad-si/rSTIM1;人源STIM1（hSTIM1, GenBank NO:U52426）重组腺病毒质粒命名为Ad-hSTIM1,由新西兰奥克兰大学分子生物实验室惠赠。纯化病毒滴度在109以上,满足在体转染的要求。2、在体动物实验部分:建立球囊损伤模型,用2%戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉。沿颈前正中线切开皮肤,在颈前三角区暴露左颈总动脉及颈内、外动脉,自颈外动脉向近心端插入1.5F球囊导管至颈总动脉起始部,2个大气压使球囊膨胀,阻断血流30秒,后慢速回拉球囊至颈内外动脉分叉处,反复3次,退出导管,注入病毒液约10μl,夹闭动脉约10分钟。结扎颈外动脉,逐层缝合皮下组织与皮肤,常规饲养。术后常规肌注青霉素以预防感染。术后7和14天取颈动脉,中间切片HE染色,图象分析软件下计算内膜与中膜面积比值。定量RT-PCR和western blot检测血管组织中STIM1的表达。免疫荧光检测血管壁STIM1的分布。Western blot来检测血管壁PCNA表达情况。3、体外细胞实验:无菌条件下取大鼠胸主动脉,采用组织贴块法培养于含20%FBS的DMEM培养液中, 37℃、5% CO2培养箱中静置培养,实验用4-6代VSMCs;将病毒液加入细胞培养上清中感染细胞,4h后更换培养基,12h后可以看见绿色荧光。采用3H-TdR掺入法和细胞记数法检测VSMCs增殖情况。激光共聚焦检测细胞内钙变化情况。流式细胞仪分析细胞周期情况,并用western blot检测细胞周期蛋白P21和PRb表达情况。Transwell小室分析细胞迁移能力。4、统计学方法:所得结果用医学图像分析系统测定其灰度值,所得数据用均值±标准差表示。用SPSS13.0对数据进行处理,两组间比较用t检验;多组间进行单因素的方差分析,组间比较用Tukey’s方法进行。以P<0.05为差异有显著性。结果1、成功构建了大鼠STIM1基因干扰的腺病毒表达载体;通过反复扩增,病毒滴度约为3×109 pfu/ml。Ad-GFP在体转染后3、7和14天,GFP蛋白水平在3天达到最高,7和14天仍可检测到表达,这表明构建的病毒质粒达到在体转染要求。对细胞进行病毒转染后,DAPI染色细胞核,记数表明转染效率达到92.4±7.6%。质粒的成功构建魏进一步研究STIM1的生物学作用以及血管平滑肌细胞增殖的内在机制奠定了基础。2、在体动物实验部分:血管壁STIM1 mRNA和蛋白表达在血管损伤后7和14天后逐渐升高,与对照组比较有显著差异（P<0.05）。免疫荧光检测表明血管壁STIM1表达与血管平滑肌细胞a-actin表达有共区域性,表明在增殖的平滑肌细胞中STIM1表达上调。分别用腺病毒阴性对照、Ad-si/rSTIM1及Ad-hSTIM1转染球囊损伤的大鼠颈动脉,在转染后7天和14天处死动物取颈动脉,Western Blotting检测STIM1表达。结果表明Ad-si/rSTIM1转染组的STIM1表达较Ad-empty转染组显著下降（P<0.05）。Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染后STIM1恢复至正常水平。转染Ad-si/rSTIM1后内膜与中膜（I/M）比值较转染阴性对照组明显减少（P<0.05）。而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染后I/M值恢复到转染对照组水平。免疫组化检测血管壁PCNA的表达,结果表明与阴性对照转染组相比,Ad-si/rSTIM1转染组PCNA表达明显降低（P<0.05）,而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染后PCNA表达恢复到转染Ad-empty组水平。同时,Ad-hSTIM1转染增加了p21表达,降低了pRb表达（P<0.05）,Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染恢复到对照组水平。3、体外细胞实验部分:分别用不同感染复数的腺病毒阴性对照、Ad-si/rSTIM1及Ad-hSTIM1转染VMSC,在转染后48h检测STIM1表达。结果表明感染复数为15和30 MOI的Ad-si/rSTIM1转染组的STIM1表达较腺病毒阴性对照转染组显著下降（P<0.05）。15 MOI的Ad-hSTIM1和15 MOI的Ad-si/rSTIM1共转染后STIM1恢复至正常水平。转染后各组细胞增殖情况:结果显示转染Ad-si/rSTIM1后3H-TdR掺入量较转染腺病毒阴性对照组明显降低,细胞记数也明显减少（P<0.05）。而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染后3H-TdR掺入量和细胞数目恢复到转染腺病毒阴性对照组水平,转染后各组细胞内Ca2+浓度变化的比较:腺病毒转染48h后用1μM TG刺激细胞,使细胞内Ca2+耗竭,加入DEME培养基后,观察细胞内Ca2+浓度的变化,取增加值比较。结果表明与腺病毒阴性对照转染组相比,Ad-si/rSTIM1转染组细胞内Ca2+浓度增加幅度明显减少（P<0.05）,而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染后Ca2+浓度增加幅度恢复到转染腺病毒阴性对照组水平。转染后各组细胞周期分布情况:结果显示转染Ad-si/rSTIM1后细胞分布于G0/G1期的细胞数目较转染腺病毒阴性对照组明显增多,S和G2/M期细胞数目明显减少（P<0.05）。而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染后细胞周期分布与转染腺病毒阴性对照组无明显差异。转染后各组细胞p21和pRb表达变化:腺病毒转染48h后对细胞内p21和pRb表达进行检测。结果表明与腺病毒阴性对照转染组相比,Ad-si/rSTIM1转染组细胞内p21表达上调、pRb表达下调（P<0.05）,而Ad-hSTIM1和Ad-si/rSTIM1共转染后p21和pRb表达恢复到转染腺病毒阴性对照组水平。结论本研究主要结论:1、球囊损伤动脉血管后STIM1表达随着VSMCs增殖逐步升高;2、RNA干扰沉默STIM1表达后显著抑制了血管损伤后内膜增生;3、RNA干扰沉默STIM1表达后可以抑制血清诱导的VSMCs增殖和迁移。这些结果表明STIM1是调控血管平滑肌细胞增殖和再狭窄形成的一个关键因素,其可能成为治疗动脉硬化和再狭窄的药物靶点。