论文摘要
抗体技术的出现对医学发展起了非常重要的推动作用，被广泛地运用于实验室研究、疾病的诊断与治疗。自20世纪70年代Kohler和Milstein利用细胞融合技术成功制备了杂交瘤单克隆抗体（McAb），其在疾病诊断、治疗和预防等方面显示出了重要作用。但是，鼠源抗体极易引起人体排异反应（Human anti-mouse antibody，HAMA）的特点限制了其在疾病治疗领域的应用。90年代兴起的噬菌体抗体库技术，从抗体角度为上述难题的解决提供了契机。噬菌体抗体库技术以PCR技术和噬菌体展示（Phage Display Techniques，PDT）技术为基础，通过构建噬菌体抗体库经抗原筛选得到特异性抗体成为获得人源抗体分子的有效途径。该技术使用聚合酶链反应（PCR）方法，把免疫球蛋白完整的抗体基因扩增出来，重组到原核表达载体中，并通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，使抗体片段表达于噬菌体表面，可以方便地利用不同抗原筛选相应的抗体。这不仅是一种制备人源性抗体的有效方法，而且能够制备具有大容量和多样性的抗体库，在获得高亲和力的抗体以及对抗体性能进行改造方面具有较强的优势。噬菌体抗体库技术的出现和发展使人们能够在体外模拟体内B细胞产生抗体的全过程，为人源抗体的制备提供了简便而高效的可操作系统，因而具有重要的理论意义和应用前景。本课题采用噬菌体抗体库这一新兴的生物学技术，构建大容量天然人源Fab抗体库：首先，RT-PCR扩增抗体重链（Fd）和轻链（VL+CL）基因片段：从未经主动免疫的健康志愿者和不同疾病患者外周血（约260ml）中获得淋巴细胞，提取总RNA，电泳结果显示完整性良好，逆转录合成cDNA第一链，根据免疫球蛋白可变区N端第一骨架区（FR1）DNA序列的相对保守性而设计的5′端引物及依据抗体J区基因序列而设计的3′端引物配对进行PCR，扩增抗体重链Fd基因和轻链基因，大小均为700bp左右。其次，轻链PCR产物重组入噬粒载体pComb3XSS：轻链PCR产物经分离纯化，与pComb3XSS分别以适量SacⅠ和XbaⅠ双酶切后进行连接，电穿孔转化感受态细胞XL1-Blue，摇菌扩增提取质粒。以适量转化细菌菌液铺板，随机挑取10个克隆，提质粒后以SacⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定目的片段VL+CL基因的插入效率。带轻链插入段的pComb3XSS，命名为pComb3XSS+L。最后，重链Fd段PCR产物重组入pComb3XSS+L，构建Fab噬菌体抗体库，进行初步筛选：摇菌扩增后提取噬粒pComb3XSS+L，用XhoⅠ和SpeⅠ酶切，与经同样双酶切的重链Fd段PCR产物连接，电穿孔转化大肠杆菌感受态细胞XL1-Blue，经辅助噬菌体VCSM13超感染，构建非免疫人源Fab噬菌体抗体库。随机挑选10个克隆酶切鉴定，提质粒后以XhoⅠ／SpeⅠ双酶切，鉴定有无Fd片段的插入，经SacⅠ／SpeⅠ酶切鉴定有无Fab的插入。得到的同时含Fd片段和轻链基因的质粒，命名为pComb3XSS（H+L）。在成功构建大容量天然人源Fab抗体库基础上，进行HAV特异性抗体的富集与淘选：包被纯化的HAV全病毒抗原于酶标板，3％BSA封闭，加人噬菌体抗体库，对其进行两轮筛选与富集，用HAV抗体诊断试剂盒对筛选结果进行测定。随机提取1个克隆的重组质粒，测定轻链（VL+CL）、重链（Fd）DNA序列并进行同源性分析。本实验成功构建了库容量为1.26×1011pfu／ml的Fab噬菌体抗体库，重组率为90％；测序结果显示重链核苷酸序列与人免疫球蛋白γ链恒定区同源性为92％，轻链核苷酸序列与λ链恒定区同源性为95％；轻、重链可变区序列属VH1基因家族，IgG亚类；竞争性ELISA检测（抗HAV单克隆抗体作为参照抗体）第二轮筛选得到的噬菌体抗体，实验结果表明，噬菌体抗体能够抑制HAV单克隆抗体与HAV的结合，其抑制率为38.61％。本研究为分子生物学实验方法的一个探索与尝试。本课题的完成，为今后筛选制备各种抗体提供了技术平台和思路，希望为本研究室的后续研究提供技术及物质支持。