论文摘要
口前,龋病仍是人类发病率最高的疾病之一,严重危害口腔健康。本课题组通过一系列实验证实防龋DNA疫苗是预防龋病发生发展的有效途径。但是DNA疫苗往往都面临着一个问题：免疫原性相对较弱,而且在大型动物和人类中的免疫效果常不理想。所以增强DNA疫苗的免疫效能依然是众多学者而临的问题。本课题组前期研究显示,DCs靶向防龋DNA疫苗较非靶向疫苗诱导了更为强烈的免疫反应。通过基因芯片分析两种DNA疫苗转染的树突状细胞抗原提呈相关基因的表达差异,发现与非靶向防龋质粒转染的树突状细胞相比,靶向防龋质粒转染的树突状细胞有28个基因表达上调,6个基因表达下调,其中趋化因子CCL19和CCL17上调最为显著（分别为8.632倍和6.996倍）,提示CCL19和CCL17可能发挥重要的免疫增强作用。趋化因子发挥作用往往通过表达于靶细胞上的趋化因子受体实现。CCL19的受体CCR7表达于成熟DCs及初始T/B细胞,CCL19在募集DCs至次级淋巴组织中具有重要作用。CCL17的受体CCR4主要表达于活化／记忆性T细胞并倾向Th2型,因此推测CCL17可能有助于诱导Th2型免疫反应。另外,CCL17在CCL19-CCR7介导的DCs迁移中发挥着重要作用。本研究根据前期基因芯片的检测结果,将CCL19和CCL17作为一种分子佐剂单独或联合应用于防龋DNA疫苗免疫,探索CCL19、CCL17质粒DNA对防龋DNA疫苗免疫效果的影响和调控机制,以及CCL19/CCL17联合佐剂策略的可能性。本研究分以下三个部分进行：第一部分CCL19加强防龋DNA疫苗系统免疫反应的研究在本研究中,我们根据GeneBank提供的小鼠CCL19序列设计引物,获得CCL19基因编码区DNA片段（不包含终止子）。将CCL19基因和pAcGFP1-N1进行连接反应,构建得到质粒pCCL19/GFP。通过Transwell趋化小室和流式细胞仪分析分别在体内和体外检测pCCL19/GFP表达的CCL19-GFP融合蛋白对DCs的趋化作用。以pCCL19/GFP为佐剂与防龋DNA疫苗pCIA-P经股四头肌注射途径共免疫小鼠。ELISA检测血清中特异性IgG水平。小鼠脾淋巴细胞经PAc蛋白刺激后,采用ELISA试剂盒测定脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平。PCR检测pCCL19/GFP肌肉注射后在脾脏和引流淋巴结中的存在。通过组织切片后荧光显微镜观察和流式细胞仪检测pCCL19/GFP在以上组织的表达。结果：Transwell趋化实验结果显示CCL19-GFP融合蛋白对BMDCs有明显的趋化作用。pCCL19/GFP共免疫的小鼠血清抗PAcIgG水平显著升高。pCCL19/GFP共免疫小鼠的脾细胞分泌IFN-γ水平明显升高,而脾细胞分泌IL-4的水平未见明显差异,提示pCCL19/GFP增强防龋DNA疫苗免疫反应倾向于Th1型。小鼠经肌肉注射pCCL19/GFP后可在次级淋巴组织中检测到质粒的存在和表达,在次级淋巴组织中CCL19表达升高趋化了更多的成熟DCs到该部位。第二部分CCL17加强防龋DNA疫苗系统免疫反应的研究在本研究中,我们根据GeneBank提供的小鼠CCL17序列设计引物,获得CCL17基因编码区DNA片段（不包含终止子）。将CCL17基因和pAcGFP1-N1进行连接反应,构建得到质粒pCCL17/GFP。以pCCL17/GFP为佐剂与防龋DNA疫苗pCIA-P经股四头肌注射途径共免疫小鼠。ELISA检测血清中特异性IgG水平。小鼠脾淋巴细胞经PAc蛋白刺激后,采用ELISA试剂盒测定脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平。通过流式细胞仪分析检测pCCL17/GFP免疫后次级淋巴组织中DCs的数量。结果：将pCCL17/GFP与防龋DNA疫苗共免疫小鼠,更快诱导了更为强烈的系统抗体反应。但pCCL17/GFP没有明显改变脾细胞分泌IFN-γ和IL-4的水平。小鼠经肌肉注射PCCL17/GFP后趋化了更多的成熟DCs到次级淋巴组织。第三部分CCL19、CCL17经鼻粘膜免疫途径加强防龋DNA疫苗免疫反应的研究在本研究中,我们以pVAX1为载体构建了质粒pCCL19/VAX和pCCL17/VAX。分别将pCCL19/VAX、pCCL17/VAX以及两者联合通过鼻腔滴注与防龋DNA疫苗pCIA-P共免疫小鼠。ELISA检测小鼠唾液和血清中特异性抗体水平。建立定菌鼠模型,检测以pCCL19/VAX、pCCL17/VAX作为分子佐剂与防龋DNA疫苗共免疫后对大鼠牙面变形链球菌数量、唾液及血清中特异性抗体浓度、龋齿计分的影响,并比较了三者间的相关性。结果：pCCL19/VAX、pCCL17/VAX单独或联合与防龋DNA疫苗经鼻腔滴注共免疫小鼠,可引起唾液和血清特异性抗体水平明显升高。pCCL19/VAX和pCCL17/VAX联合免疫的抗体水平高于pCCL19/VAX、pCCL17/VAX单独免疫。pCCL19/VAX、pCCL17/VAX单独或联合与防龋DNA疫苗共免疫定菌鼠.可明显减少大鼠口腔中变形链球菌的数量,引起唾液和血清特异性抗体水平升高,并明显减少龋齿发生率。而pCCL19/VAX、pCCL17/VAX联合免疫优于单独免疫。另外,唾液特异性IgA浓度与龋齿总记分呈显著负相关,CFU值与唾液特异性IgA浓度呈显著负相关,CFU值与龋齿总记分呈显著正相关。
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