肝细胞核因子4诱导肝细胞功能的体外和体内研究

论文摘要

背景与目的:肝细胞移植（hepatocyte transplantation,HCT）是治疗晚期肝硬化和肝功能衰竭的重要方法,但存在的主要问题是供体细胞功能不完善。肝细胞核因子4（hepatocyte nuclear factor, HNF4）是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白。本实验利用表达HNF4α的腺病毒AdHNF4α对HNF4诱导的肝细胞功能进行了体外和体内的初步研究。方法:本研究首先比较不同肝细胞中HNF4α和肝细胞相关功能基因的表达情况,然后构建了表达HNF4α的腺病毒AdHNF4α,并体外感染人肝肿瘤细胞株（HepG2和Hep3B）以及小鼠胚胎干细胞,分别观察HNF4α基因上调对其生物学功能的影响;并应用HNF4α基因修饰HepG2细胞治疗急性肝功能衰竭小鼠,初步观察小鼠生存率和肝功能改善情况。结果:HNF4α在正常成熟的肝细胞中表达最高,同时肝细胞生物学功能基因表达水平与HNF4α的表达密切相关。将外源HNF4α基因导入肝肿瘤细胞可增强正常肝细胞重要功能基因表达。上调小鼠胚胎干细胞HNF4α表达,可明显提高正常肝细胞如CYP1a2、G-6-P、PAH以及ALB等功能基因的表达,糖原合成和ICG代谢功能显著增强,ES细胞向肝细胞定向分化的能力明显提高。利用HNF4α基因修饰的HepG2移植治疗急性肝功能衰竭小鼠可明显提高动物模型的生存率,有效改善肝功能。结论:HNF4α是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白。上调供体肝细胞中HNF4α的表达,可明显增强肝细胞功能,因此HNF4α基因修饰肝细胞有望成为治疗急性肝功能衰竭的有效工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 详细摘要
• 前言
• 第一部分 肝细胞核因子4α和肝细胞相关功能基因在不同肝细胞、肝肿瘤细胞及ES 细胞的表达
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 RT-PCR 检测人正常成熟肝细胞、人肝肿瘤细胞株以及人FLC 株HNF4α以及肝细胞相关功能基因的表达
• 1.2.2 RT-PCR 检测小鼠不同发育阶段的FLC HNF4α以及肝细胞相关功能基因的表达
• 1.3 讨论
• 第二部分 重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• TM重组腺病毒系统'>2.2.1 AdEasy^TM重组腺病毒系统
• 2.2.2 获取HNF4α14256p cDNA 片段
• 2.2.3 体外连接获取穿梭质粒pAdTrack-CMV-HNF4α
• 2.2.4 细菌内同源重组产生腺病毒质粒pAdHNF4α
• 2.2.5 293 细胞内包装、扩增腺病毒AdHNF4α
• 2.2.6 RT-PCR 法测定AdHNF4α上调L02 细胞中HNF4α表达
• 2.2.7 Western blot 检测AdHNF4α上调L02 细胞中HNF4α表达
• 2.3 讨论
• 第三部分 外源导入肝细胞核因子4α对人肝肿瘤细胞生物学特性的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后HNF4α mRNA 和蛋白表达检测
• 3.2.2 AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后肝细胞相关功能基因表达测定
• 3.2.3 AdHNF4α感染肝肿瘤细胞后细胞凋亡率的检测
• 3.3 讨论
• 第四部分 外源导入肝细胞核因子4α对小鼠ES 细胞生物学特性的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 PMEF 的制备
• 4.2.2 小鼠ES 细胞株ES-D3 培养
• 4.2.3 AdHNF4α感染小鼠ES 细胞后HNF4α表达测定
• 4.2.4 ICC检测CK8、CK18、AFP和ALB表达
• 4.2.5 RT-PCR检测ES细胞在分化过程中肝细胞相关功能基因表达
• 4.2.6 PAS染色法检测糖原合成
• 4.2.7 吲哚氰绿吸收染色实验
• 4.3 讨论
• 第五部分 HNF4α基因修饰HepG2治疗小鼠急性肝功能衰竭的初步研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 小鼠生存率
• 5.2.2 一般情况
• 5.2.3 肝脏组织HE 染色
• 5.2.4 血清学检查
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 硕士期间发表论文及获奖情况
• 硕士期间获奖情况