硫糖肽的制备及其抗胃溃疡的活性研究

论文摘要

胃溃疡（gastric ulcer, GU）指胃内受胃液、胃酸和胃蛋白酶调节范围的黏膜层、黏膜下层,甚至肌层和浆膜在多种因素的影响下发生的局限性组织缺损性疾病。其主要特点是容易复发,难于防止,因此提高溃疡愈合质量是治愈GU的关键因素。近年来研究表明溃疡愈合质量与修复受损黏膜密切相关,GU的愈合不仅要求黏膜表面的修复,下层的修复更为重要。通过对GU发病机制的研究发现抗炎和胃肠粘膜保护已经成为GU治疗的重要原则。黏多糖类物质作为构成生命的基本物质之一,参与许多重要的生理活动,其独特的生物活性已成为生物化学和医学领域的研究热点。目前发现的具有生物活性的糖类已有上百种,对其结构和功能的研究越来越深入,其中黏多糖类广泛的抗炎活性引起人们的重视,且其作用机制多样,同时发现经过修饰后的糖类衍生物,由于其结构的改变,生物活性也有显著的增强。鉴于此,本实验采用硫糖肽为研究对象,以猪十二指肠为原料提取糖肽,经磺化修饰制备硫糖肽；并进行处方优化,在此基础以猪十二指肠类肝素为原料开辟制备硫糖肽的新途径,制备硫糖肽类物质；用大鼠胃溃疡模型进行抗胃溃疡活性筛选,并对活性硫糖肽进行分离纯化,测定其分子量；为比较硫糖肽的药理活性与其糖链部分的关系,采用酶解法将硫糖肽中的糖链释放出；为研究硫糖肽的抗炎和抗溃疡活性,本实验在体外检测了硫糖肽及其糖链对大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α和IL-4的作用,并在体内考察硫糖肽对实验性胃溃疡大鼠的治疗作用。本研究取得的结论有以下几个方面：1糖肽的提取制备及磺化工艺优化猪十二指肠经过脱脂、酶解和离子交换纯化得到粗品糖肽,运用强阴离子交换树脂交换吸附杂质,精制糖肽,收率为0.96%～1.17%,比文献报道的0.5%～0.66%提高将近一倍。醋酸纤维素薄膜电泳鉴定产物较为纯净,利用苯酚-硫酸法测定其总糖含量为（22.47±1.41）%,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定糖肽蛋白含量为（14.15±1.06）%。糖肽采用三种磺化方法进行化学修饰,产物表示为SG。通过三种方法的优劣比较,确定采用氯磺酸-甲酰胺法,进而设计反应温度、反应时间、氧化除氨pH三个因素考察在此条件下四个水平的工艺路线,设计正交试验进行处方优化,以产物硫酸基团和总糖含量作为检测指标,筛选出磺化最佳工艺为氯磺酸-甲酰胺法,反应温度23℃,反应时间8h,氧化除氨pH9.5。采用最佳工艺磺化三个批次的类肝素产品,产物以HPS-1,HPS-2, HPS-3表示,探索制备硫糖肽的新途径。各批次磺化产物产物采用超滤脱盐,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度。2具有抗胃溃疡作用的活性硫糖肽的筛选及分离纯化无水乙醇灌胃处理大鼠,建立大鼠胃溃疡模型,以溃疡指数、病理切片为检测指标,从四种磺化产品中筛选出具有抗胃溃疡活性的硫糖肽SG和HPS-1。结果表明硫酸基团和总糖含量较高者,抗胃溃疡活性为强。QFF强阴离子交换层析色谱对活性硫糖肽进行分离纯化,得到不同离子强度的硫糖肽组分SG-1、SG-2、SG-3、SG-4、SG-5以及HPS-1-1、HPS-1-2。3硫糖肽中糖链的释放及硫糖肽分子量的测定采用酶解法释放出活性硫糖肽中的糖链,产物分别为S-1和H-1。紫外扫描光谱技术（UV）考察硫糖肽及其糖链的特征吸收情况,结果显示硫糖肽中含有多糖和氨基酸组分,而糖链中仅有多糖。运用多角度激光散射技术确定活性硫糖肽各组分的重均分子量Mw,其中SG和HPS-1分子量分别为99.54kDa和33.97kDa。4硫糖肽各组分及糖链部分对大鼠腹腔巨噬细胞生长因子的影响利用贴壁纯化法培养大鼠腹腔巨噬细胞,采用台盼蓝拒染实验和MTT实验测定硫糖肽各组分及其糖链部分对巨噬细胞的细胞活力的作用,酶联免疫吸附实验（ELISA）测定大鼠腹腔巨噬细胞上清液中TNF-α和IL-4的含量。结果显示硫糖肽糖链及其组分对巨噬细胞表现为细胞抑制作用,随着浓度升高,抑制作用更加明显,抑制作用最明显的为SG-4,其在10μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL不同浓度下对巨噬细胞的抑制率分别为（1.69±0.32）%、（4.31±0.43）%、（6.16±0.37）%、（8.71±0.82）%。通过硫糖肽对TNF-α和IL-4表达的抑制作用,筛选出疗效较好的组分：SG-3、SG-4,其中Rat TNF-α在SG-3浓度分别为250μg/mL和500μg/mL中的含量307.40±25.71 pg/mL和230.59±24.42 pg/mL, SG-4浓度分别为250μg/mL和500μg/mL中Rat TNF-a的含量为243.55±4.18 pg/mL和207.18±35.68 pg/mL,明显低于模型组508.09±30.53pg/mL,Rat IL-4在SG-3浓度分别为250μg/mL和500μg/mL中的含量54.98±1.03pg/mL和46.43±0.55 pg/mL,SG-4浓度分别为250μg/mL和500μg/mL中Rat IL-4的含量为49.98±1.68 pg/mL和43.40±1.20 pg/mL,明显低于模型组73.43±4.54 pg/mL。初步证实硫糖肽各组分及其糖链部分对巨噬细胞分泌前炎症细胞因子有抑制作用。5 SG-3和SG-4对实验性胃溃疡大鼠的治疗作用采用改良Okabe法建立大鼠胃溃疡模型,考察SG-3和SG-4对实验性胃溃疡大鼠的治疗作用。溃疡组织HE染色显示不同浓度的SG-3和SG-4均能治疗大鼠胃溃疡。考察了硫糖肽对Caspase 3、EGFR、NO、NOS和EGF、ET-1的表达情况。治疗16d后,高剂量的SG-4对上述指标的的表达作用分别是：caspase3抑制率为（81.22±1.62）%,EGFR增长2.25±0.11倍,NO下降至（34.55±2.38）μmol/L, cNOS增加至（8.43±0.84）U/mL, iNOS下降至（6.81±1.99）U/mL, EGF增加至（35.49±2.67） pg/mL, ET-1下降至（6.31±0.32） pg/mL,与模型组相比具有显著差异,并与剂量成正相关,随治疗时间和剂量增加而表现明显的改善作用。通过四个给药组对胃溃疡大鼠Caspase 3、EGFR、NO、NOS和EGF、ET-1表达的显著改善效果,证实了硫糖肽其对胃溃疡大鼠的治疗作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1 GU发病机制
• 1.1 胃粘膜损伤与GU
• 1.2 炎症细胞与GU
• 1.3 炎症因子与GU
• 1.4 保护因子与GU
• 2 促进GU愈合的多种机制
• 2.1 改善粘膜微循环
• 2.2 调节细胞因子表达
• 3 GU治疗现状
• 4 SG的生物学功能
• 4.1 抗炎活性
• 4.2 抗溃疡活性
• 4.3 抗口腔黏膜炎活性
• 4.4 其他
• 5 本课题拟解决的问题
• 第二章 硫糖肽的制备、工艺优化及其理化性质测定
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 糖肽的制备和纯化
• 2.2 糖肽的醋酸纤维素薄膜电泳
• 2.3 糖肽的理化性质测定
• 2.4 硫糖肽的制备
• 2.5 磺化产物的超滤脱盐
• 2.6 磺化产物理化性质测定
• 3 结果
• 3.1 糖肽的制备及纯化
• 3.2 糖肽的醋酸纤维素薄膜电泳
• 3.3 糖肽的理化性质测定
• 3.4 硫糖肽的工艺优化
• 3.5 硫糖肽的理化性质测定
• 4 讨论
• 第三章 硫糖肽的活性筛选及分离纯化
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 硫糖肽的活性筛选
• 2.2 硫糖肽的分离纯化
• 2.3 硫糖肽的糖链释放
• 2.4 硫糖肽的分子量测定
• 2.5 紫外光谱扫描
• 3 结果
• 3.1 活性硫糖肽筛选
• 3.2 硫糖肽的分离纯化
• 3.3 硫糖肽的分子量测定
• 3.4 紫外光谱扫描
• 4 讨论
• 4.1 各磺化产物的活性筛选
• 4.2 硫糖肽的分离纯化
• 4.3 硫糖肽的糖链释放
• 4.4 硫糖肽各的分子量测定
• 4.5 紫外光谱扫描
• 第四章 硫糖肽对大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-4分泌的影响
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 1.4 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 大鼠腹腔巨噬细胞的制备
• 2.2 大鼠腹腔巨噬细胞的纯化以及细胞活力的测定
• 2.3 硫糖肽各组分对大鼠腹腔巨噬细胞相关因子的作用
• 2.4 数据处理
• 3 结果
• 3.1 大鼠腹腔巨噬细胞活力的测定
• 3.2 硫糖肽各组分对大鼠腹腔巨噬细胞相关因子的影响
• 4 讨论
• 4.1 硫糖肽对巨噬细胞细胞活力的影响
• 4.2 硫糖肽对巨噬细胞相关因子的抑制作用
• 第五章 硫糖肽对乙酸诱导的大鼠胃溃疡的影响
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 大鼠胃溃疡模型的建立
• 2.2 胃溃疡标本的收集及检测指标
• 2.3 胃溃疡大鼠病理形态的检测
• 2.4 caspase 3表达水平的测定
• 2.5 EGFR表达水平的测定
• 2.6 血清学检查
• 2.7 血浆学检查
• 2.8 数据处理
• 3 结果
• 3.1 各组大鼠状态变化
• 3.2 胃溃疡大鼠病理形态的检测结果
• 3.3 SG对胃溃疡大鼠caspase 3表达的抑制
• 3.4 SG对胃溃疡大鼠EGFR表达的促进作用
• 3.5 血清学检查
• 3.6 血浆学检查
• 4 讨论
• 论文总结与创新
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表