葡聚糖—寡胺阳离子化合物的制备及其基因转染效率的研究

论文摘要

本研究的目的是制备具有转基因功能的葡聚糖-寡胺阳离子化合物基因载体，其意义在于探索非病毒基因载体，解决基因治疗的载体问题。目前用于基因治疗的病毒性载体虽然具有较高的转染效率，但其体内毒性、免疫原性等诸多缺陷限制了其应用，而安全无毒、生物相容性好的非病毒基因载体则有望弥补病毒性载体的不足并成为基因治疗的新一代载体。 以目前非病毒基因载体中前景较好的葡聚糖-寡胺阳离子化合物为研究对象，从多种葡聚糖-寡胺阳离子化合物中优选出转染能力最强的载体，并对其进行进一步的研究，力图找出影响该化合物基因转染能力的因素和内在规律。本研究的主要研究方法、内容、结论包括以下几个方面。 首先，将分子量不同的葡聚糖10（Dextran10）、葡聚糖40（Dextran40）、葡聚糖70（Dextran70）分别氧化成三种氧化度不同的氧化葡聚糖，共制备9个品种的氧化葡聚糖，并以盐酸羟胺法测定了各种氧化葡聚糖分子上的醛基含量。在预试验的基础上以载体的基因转染效率为考察指标，通过正交试验考察影响载体转染效率的因素并优选载体的制备条件，结果氧化葡聚糖的种类、氧化葡聚糖的氧化度（醛基含量）、反应物寡胺与醛基的配比、寡胺的种类四种因素对转染效率均有显著的影响（p值均小于0.05），载体的最佳制备条件为：高氧化

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• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 葡聚糖-寡胺阳离子化合物纳米粒非病毒基因载体的合成
• 1.1 仪器与试药
• 1.2 基因载体的合成路线
• 1.3 氧化葡聚糖的制备
• 1.3.1 制备方法
• 1.3.2.氧化葡聚糖的分离
• 1.3.3 氧化葡聚糖的表征
• 1.3.4 氧化葡聚糖的醛基含量测定
• 1.3.5 氧化葡聚糖收率的计算
• 1.3.6 正交试验
• 1.3.7 九种氧化葡聚糖的制备
• 1.4 葡聚糖-寡胺阳离子化合物纳米粒基因载体的制备
• 1.4.1 基因载体的合成
• 1.4.2 载体转染效率的测定
• 1.4.3 基因载体的优选
• 第二章 基因载体的表征
• 2.1 仪器与试药
• 2.2 红外光谱测定
• 2.3 紫外光谱测定
• 2.4 核磁共振测定
• 2.5 粒径及分布
• 2.6 Zeta电位测定
• 2.7 电镜形态观察
• 2.8 载体上含伯胺基的精胺的含量测定
• 2.8.1 试液的配制
• 2.8.2 标准曲线的制备
• 2.8.3 精密度试验
• 2.8.4 回收率测定
• 2.8.5 样品测定
• 2.9 载体上精胺的总含量测定
• 2.10 讨论
• 2.11 小结
• 1报告基因的制备及鉴定'>第三章 pEGFP-C₁报告基因的制备及鉴定
• 3.1 仪器与试药
• 3.2 试液的配制
• 1报告基因的转化'>3.3 重组pEGFP-C₁报告基因的转化
• 3.3.1 感受态细菌的制备
• 3.3.2 pEGFP-C1重组子的转化
• 1重组子的提取'>3.4 pEGFP-C₁重组子的提取
• 3.4.1 细菌的增殖和质粒的扩增
• 3.4.2 裂解菌体,提取质粒
• 1质粒的纯化'>3.5 pEGFP-C₁质粒的纯化
• 3.6 pEGFP-C1质粒的鉴定
• 3.7 紫外分光光度法检测pEGFP-C1质粒的浓度和纯度
• 3.8 讨论
• 3.9 小结
• 第四章 基因转染
• 4.1 仪器与试药
• 4.2 细胞培养
• 4.2.1 细胞的复苏
• 4.2.2 细胞的传代和细胞接种密度的确定
• 4.3 DNA-载体复合物的制备
• 4.3.1 定量关系的确立
• 4.3.2 制备方法
• 4.4 载体对DNA的结合压缩试验
• 4.5 DNA阻滞试验
• 4.5.1 DNA电泳检测浓度的确定
• 4.5.2 DNA阻滞试验
• 4.6 基因转染试验
• 4.7 影响载体转染效率的因素考察
• 4.7.1 载体／DNA用量比对转染效率的影响
• 4.7.2 合成反应中精胺与氧化葡聚糖醛基摩尔比对转染效率的影响
• 4.7.3 葡聚糖氧化度对转染效率的影响
• 4.8 讨论
• 4.9 小结
• 全文小结
• 1 小结
• 2 创新点
• 3 本文存在的问题
• 4 进一步研究展望
• 发表论文目录
• 致谢
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