碱篷SsNHX1基因转化玉米的耐盐性研究

论文摘要

土壤中高浓度的盐分会造成植物体内离子失衡、氧化伤害、水分亏缺、营养缺乏并导致生物大分子破坏、生长迟缓、甚至植株死亡,从而导致作物的减产或绝收。因此,培育耐盐植物品种、加强盐碱土的生物治理与综合开发具有重要意义。玉米作为重要的粮食作物之一在我国农业发展中发挥着重要作用,但大多数玉米品种耐盐能力较弱,很难适应高盐的生长环境。对其进行遗传改良,培育具有较强耐盐性的新品系,对我国农业的可持续发展、生态环境的恢复重建以及盐碱地和荒漠化土地的改良利用具有重要的现实意义。本试验以玉米自交系18-599为材料,利用同源克隆的方法克隆了碱篷SsNHX1基因并通过根癌农杆菌介导法成功将其转入玉米18-599自交系。获得了过量表达SsNHX1的玉米转基因植株。比较野生型和转基因玉米不同株系之间的抗盐差异。本文主要研究结果如下：1构建了过量表达载体pCPB-SsNHX1。通过幼胚浸染遗传转化法将SsNHX1转入玉米幼胚及通过基因枪转化法导入玉米愈伤组织中,PCR检测测序结果表明该基因已成功转入玉米中,RT-PCR结果表明转基因的不同株系之间SsNHX1基因表达量有差异。2进一步优化了玉米自交系18-599农杆菌侵染幼胚遗传转化方式,幼胚大小为0.8-1.2 mm时,愈伤组织诱导率最高,能达到为96%；转化时间约为10周即可检测得到T0代阳性植株,很大程度缩短了农杆菌浸染遗传转化阶段的时间。3 SsNHX1转基因玉米植株的耐盐性分析表明,SsNHX1的过表达增强了转基因玉米的耐盐性。对玉米种子进行1.0%NaCl处理后,野生型种子发芽率仅为5%,转基因种子发芽率最高达到79%,后面继续浇灌盐水,野生型玉米出现新叶萎蔫、甚至死亡,而转基因玉米仍然能够正常生长。4在盐胁迫条件下,过表达SsNHX1转基因玉米比野生型植株在叶和根中积累了更多的Na+、K+。大量积累阳离子造成转基因玉米叶片渗透势显著低于野生型玉米,在盐胁迫下仍可维持较高的叶片相对含水量。此外,在盐胁迫条件下,转基因玉米叶片把丙二醛含量和相对电导率均显著低于野生型玉米植株,叶绿素含量显著高于野生型植株。这些结果均说明SsNHX1基因的超表达促进了转基因玉米细胞中Na+向液泡中的区域化,提高了耐盐能力。5对过表达SsNHX1转基因玉米及对照材料进行干旱胁迫处理,发现SsNHX1基因过表达转基因玉米植株生长更快,且耐旱性增强。随着干旱时间延长,对照玉米叶片发生萎焉,生长受到严重抑制,最终死亡,而转基因玉米保持正常生长,表现出更强的抗旱性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 盐害的特点
• 1.2 植物对盐胁迫的适应机制
• 1.2.1 活性氧清除系统
• 1.2.2 合成渗透调节蛋白
• 1.2.3 耐盐基因的诱导表达
• 1.2.4 渗透调节机制
• 1.2.5 离子跨膜运输与离子区隔化
• 1.3 植物液泡膜NHX1的研究进展
• +/H⁺逆向转运蛋白的结构'>1.3.1 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的结构
• +/H⁺逆向转运蛋白的作用机制'>1.3.2 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的作用机制
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的表达特性'>1.3.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的表达特性
• 1.3.4 盐胁迫的调控机制
• +/H⁺逆向转运蛋白研究进展'>1.3.5 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白研究进展
• 1.4 玉米转基因方法的研究进展
• 1.4.1 基因枪介导法
• 1.4.2 根癌农杆菌介导
• 2 立题依据
• 3 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株、质粒和引物
• 3.1.3 主要试剂和仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 SsNHX1过量表达载体的构建
• 3.2.2 目的基因的扩增
• 3.2.3 表达载体的构建
• 3.2.4 农杆菌浸染
• 3.2.5 基因枪介导的NHX1载体对玉米愈伤的转化
• 3.2.6 抗性愈伤的筛选、分化、壮苗及炼苗、移栽
• 3.2.7 SsNHX1转基因玉米DNA提取检测
• 3.2.8 SsNHX1转基因玉米的耐盐性及生理生化指标检测
• 3.2.9 数据分析
• 4 实验结果与分析
• 4.1 植物表达载体pCPB-SsNHX1的构建
• 4.2 SsNHX1转基因玉米的获得
• 0代的PCR分析结果'>4.2.1 SsNHX1转基因玉米T₀代的PCR分析结果
• 4.3 SsNHX1转基因玉米生理生化耐盐性检测结果
• 4.3.1 SsNHX1转基因玉米PCR结果及RT-PCR结果
• 4.3.2 SsNHX1转基因玉米耐盐性结果
• 4.3.3 SsNHX1盐胁迫下转基因玉米种子发芽率统计结果
• +和Na⁺含量分析'>4.3.4 SsNHX1转基因玉米叶片和根系中K⁺和Na⁺含量分析
• 4.3.5 SsNHX1转基因玉米叶片相对水含量分析
• 4.3.6 SsNHX1转基因玉米株根系影响
• 4.3.7 SsNHX1转基因玉米叶片丙二醛（Malon dialdehyde MDA）含量分析
• 4.3.8 SsNHX1转基因玉米相对电导率含量分析
• 4.3.9 SsNHX1转基因玉米叶绿素含量分析
• 4.3.10 SsNHX1转基因玉米耐旱性表型分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 SsNHX1过量表达与玉米耐盐性
• 4.4.2 SsNHX1过量表达与玉米的耐盐性分析
• 4.4.3 SsNHX1转基因玉米提高了玉米的耐旱性
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢