论文摘要
EMD-621为人工合成的结构新化合物,本文首次对其体内外抗肿瘤活性进行了较为系统的研究,主要探讨了EMD-621在两种肿瘤细胞:人胃腺癌SGC-7901细胞、人宫颈癌HeLa细胞诱导细胞凋亡的机制;另外还研究了N-去甲基克拉霉素诱导HeLa细胞凋亡的机制。体内实验结果表明,EMD-621对荷S180的昆明种小鼠移植肿瘤有一定的抑制作用;体外实验结果表明,EMD-621对人宫颈癌(HeLa),人乳腺癌(MCF-7),人胃腺癌(SGC-7901),人慢性骨髓性白血病细胞(K562)均有明显的细胞毒作用。EMD-621对小鼠成纤维细胞(3T3)也有一定的细胞毒作用,但在等剂量下其毒性远低于顺铂。用形态学方法、核荧光染色、DNA片段化分析、LDH活力测定、细胞周期分布分析及Annexin V-FITC检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻实验充分证实了EMD-621诱导HeLa和SGC-7901细胞死亡机制为细胞凋亡。3.4μmol·L-1 EMD-621作用于HeLa细胞后,半胱氨酸天冬氨酸酶-3(cysteinyl aspirate specific proteinase-3,caspase-3)和-8的酶原被降解,caspase家族抑制剂、caspase-1、-3和-8的抑制剂可部分抑制细胞死亡,caspase-10抑制剂几乎没有作用,而caspase-9抑制剂则增加了细胞死亡率。Caspase-3底物caspase-3依赖型的DNA酶抑制物(inhibitor of caspase activated DNase,ICAD)和多聚腺苷二磷酸聚合酶(poly-(ADP-ribose)polymerase,PARP)降解,表明EMD-621诱导HeLa细胞凋亡时激活了caspase级联反应,但是caspase-9没有参与其中;死亡受体的配体FasL表达增加,推测EMD-621可能同时诱导FADD(Fas-associated protein with death domain)的表达,激活了下游的caspase途径;促凋亡蛋白Bax(Bcl-2 associated X protein)表达增加,抑凋亡蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-leukemia-2 gene,Bcl-2)表达降低,Bax/Bcl-2表达的比率在药物作用12h后随时间延长而升高,罗丹明123(rhodamine123)染色可见线粒体膜电位下降,表明EMD-621诱导细胞凋亡时激活以线粒体为中心的信号转导途径。细胞凋亡早期p21水平短暂升高,但此后很快被降解;药物作用12h后即可见p53表达增加,并且其表达强度逐渐增加;抗凋亡蛋白SIRT1的表达随着药物作用时间的延长而降低;p38抑制剂SB203580降低细胞的死亡率,细胞外信号调控的蛋白激酶(extracellularsignal-regulated protein kinase,ERK)抑制剂PD98059增加细胞的死亡率,c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制剂SP600125对细胞没有作用;ERK在12h时被抑制,p38在12h时被激活,表明p38发挥了促进细胞凋亡的作用而ERK发挥了促进细胞增殖的作用。EMD-621作用HeLa细胞24h,下调了Ser/Thr激酶Akt的表达,p-Akt先增加后降低,表明Akt参与了EMD-621诱导的HeLa凋亡。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)家族成员在EMD-621诱导HeLa细胞凋亡过程起到促细胞增殖作用。PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)抑制剂wortmannin和PKC家族抑制剂staurosporine均更为显著地增加了EMD-621对ERK蛋白表达及其磷酸化的抑制。以上结果提示我们在HeLa细胞中,ERK对细胞的保护作用可能是依赖上游的PI3K和PKC途径实现的。wortmannin和staurosporine增加了EMD-621对SIRT1表达的抑制,表明SIRT1的失活可能受PI3K家族不同成员以及PKC不同亚型的调控。核内因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抑制剂PDTC和蛋白消化体(proteasome)抑制剂MG132,增加了细胞的死亡率,同时IκBα也随药物作用时间的延长而被降解,说明NF-κB可能在EMD-621诱导HeLa细胞凋亡过程中发挥作用。酪氨酸激酶在EMD-621诱导HeLa细胞凋亡过程起到促细胞增殖作用。1.6μmol·L-1EMD-621作用于SGC-7901细胞12h后,caspase-3酶原被降解,同时ICAD和PARP降解,caspase家族抑制剂、caspase-1、-3和-10的抑制剂可部分增加细胞死亡,而caspase-8抑制剂却显著降低了SGC-7901细胞对药物的敏感性,caspase-9抑制剂几乎没有作用,表明EMD-621诱导SGC-7901细胞凋亡时caspase家族成员起到保护细胞作用。采用ORAC方法考察了EMD-621对活性氧清除的影响,结果提示EMD-621几乎无清除活性氧的能力。加入caspase家族抑制剂后,免疫印迹结果显示PARP仍被降解,进一步证明存在caspase非依赖性蛋白降解了PARP;FasL的表达先短暂增加而后减少,而FADD表达呈时间依赖性减少,推测很可能存在新的作用靶点;药物作用12h后Bax表达显著升高,Bcl-2表达显著下降,细胞色素c的释放也随着药物作用时间的延长而增加,rhodamine123染色可观察到线粒体膜电位下降,表明EMD-621通过改变Bax/Bcl-2的表达,激活以线粒体为中心的信号转导途径而诱导细胞凋亡。药物作用12h后p53表达水平升高,SIRT1表达下调,表明EMD-621能够下调SIRT1蛋白,从而促进了p53和Bax上调。p38、ERK均被激活,p38对凋亡有促进作用,ERK发挥了促进细胞增殖的作用,而JNK几乎没有发挥作用。EMD-621作用SGC-7901细胞12h,下调了Akt的表达,p-Akt也呈时间依赖性减少,表明Akt参与了EMD-621诱导的SGC-7901凋亡。NF-κB抑制剂PDTC和proteasome抑制剂MG132增加了细胞的死亡率,并且IκBα随药物作用时间的延长而被降解,说明NF-κB可能在EMD-621诱导SGC-7901细胞凋亡过程中发挥作用。PKC家族成员以及酪氨酸激酶在EMD-621诱导SGC-7901细胞凋亡过程中均起到促细胞增殖作用。本论文首次发现N-去甲基克拉霉素具有抗癌活性。60μmol·L-1N-去甲基克拉霉素作用于HeLa细胞,形态学方法、核荧光染色、DNA片段化分析、LDH活力测定表明N-去甲基克拉霉素诱导HeLa细胞死亡机制为凋亡。实验结果表明药物作用后caspase-3酶原被降解,产生有活性的小片段caspase-3,同时ICAD和PARP降解,DNA片段化,caspase家族抑制剂,caspase-3、-9的抑制剂可部分抑制细胞死亡,表明N-去甲基克拉霉诱导HeLa细胞凋亡时激活了caspase级联反应。Bax/Bcl-2在药物作用后随时间延长而升高,抗凋亡成分Bcl-XL蛋白的表达不受影响,Cyt.c从线粒体释放到胞浆逐渐增多,表明N-去甲基克拉霉素通过增加Bax/Bcl-2的比例,降低了线粒体膜电位,激活以线粒体为中心的信号转导途径而诱导细胞凋亡。N-去甲基克拉霉素能够下调SIRT1蛋白,从而促进了p53和Bax上调。在N-去甲基克拉霉素诱导的HeLa细胞凋亡中,p38、ERK和JNK均被激活,并且三种MAPK的特异性抑制剂均对凋亡有促进作用,表明它们均发挥了促进细胞增殖的作用。N-去甲基克拉霉素作用HeLa细胞24 h,下调了Akt的表达,p-Akt先增加后开始降低,表明Akt参与了N-去甲基克拉霉素诱导的HeLa凋亡。NF-κB抑制剂PDTC和proteasome抑制剂MG132增加了细胞的死亡率,并且IκBα随药物作用时间的延长而被降解,说明NF-κB可能在N-去甲基克拉霉素诱导HeLa细胞凋亡过程中发挥作用。