脂质体槲皮素诱导食管癌细胞逆转化及可能机制的研究

论文摘要

槲皮素（quercetin）是黄酮类化合物（flavanoid）的一个成员,化学名称为3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮（pentahydroxyflavone）。槲皮素在植物界分布广泛,对正常细胞有抗氧化、清除体内自由基、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒,抑制恶性肿瘤生长和转移等多方面药理作用,是近年来国内外学者研究的热门课题之一。由于槲皮素难溶于水,在体外研究可采用小于0.1%的二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂,以终浓度为40μmol/L的槲皮素溶液处理培养细胞,虽未对所培养的细胞产生不良效应,但考虑到DMSO不适于体内应用的问题。为解决该问题,采用脂质体（liposomal）包被药物,以提高药物的溶解性,并增加疗效。食管鳞癌（esophageal squamous epithelial carcinoma,ESEC）是发生在食管鳞状上皮组织的恶性肿瘤。我国是食管癌的高发国家之一。癌细胞的特征为具有抵抗低氧、化学药物以及辐射等伤害而呈现失调的异常增殖能力,cyclin D1高表达,与增殖密切相关的PI3k/Akt信号转导途径不能被失活的PTEN抑癌基因所抑制。食管癌细胞过高表达的c-met,VEGF恶性标志等为低氧条件下诱导形成的,调节氧化应激水平可提供针对抗癌细胞和癌干细胞治疗的靶点。有报道指出,氧化应激（ROS）参与槲皮素诱导肝瘤细胞的凋亡。此外,槲皮素对非转化的正常细胞具有抗氧化应激反应,不但不会如化疗药物那样伤及正常细胞,而且尚具有防癌效应。因此槲皮素不但具有抗癌,而且具有防癌效应。本实验通过制备不同脂质体槲皮素（liposomal quercetin,LQ）,作用于Ecal09/9706细胞,应用光学显微镜进行形态学观察,MTT实验检测其对细胞活性抑制的影响,检测NO细胞化学活性和羟自由基水平,比较其对细胞氧化应激的作用[氧化应激包含反应氧族,ROS(O2.-,H2O2,·OH)和反应氮族,RNS（NO,ONOO-）两者]。通过测定c-met,VEGF,cyclin D1和PTEN免疫组织化学反应和免疫印迹,探讨其对癌细胞恶性逆转化的效应及可能机制。目的1.比较制备的不同脂质体槲皮素对培养的食管癌细胞的生物学效应。2.观察脂质体槲皮素诱导人食管癌Ecal09/9706细胞的氧化应激反应和对癌细胞恶性逆转化效应的影响,并探究两者间的关联机制。方法1.主要采用旋转蒸发法制备脂质体槲皮素,制备按一定比例的氯仿和甲醇溶解类脂物质的脂质体槲皮素LQ1,制备按同比例的氯仿和DMSO作为溶剂的脂质体槲皮素LQ2。油红-O染色观察所制备的脂质体槲皮素的形态。用DMSO直接溶解槲皮素,制备非脂质体槲皮素（non-liposomal quercetin,nLQ）。2.MTT实验检测脂质体槲皮素对Ecal09/9706细胞活性的抑制率,实验分为四组:LQ1组、LQ2组、nLQ组、对照组。3.脂质体槲皮素处理48h后的Ecal09/9706细胞,检测NO细胞化学活性和用试剂盒检测羟自由基水平。4.免疫组织化学染色检测PTEN,c-met,VEGF和cyclin D1,在脂质体槲皮素处理48h后Ecal09/9706细胞中表达及定位的改变。5.脂质体槲皮素处理48h后的Ecal09/9706细胞,以Trizol试剂提取其总蛋白质,检测蛋白质浓度后进行SDS-PAGE电泳。6.将SDS-PAGE电泳胶转膜于硝酸纤维素膜（NCM）上,对c-met,VEGF,cyclinD1和PTEN（以β-actin作为内参照）进行免疫印迹定性及半定量。7.统计分析采用SPSS 12.0软件进行统计分析,服从正态分布的数据变量数据以均数±标准差（（?）±s）表示,不同处理组间均数的比较采用单因素方差分析,指标间的相关性采用二元变量的相关分析。结果判断以α=0.05为显著性水准。结果1.在脂质体槲皮素的溶解度和均匀性方面:LQ2组优于LQ1组。在油镜下可见LQ2组的微粒呈均匀分布,红色类脂物质包围着一个中心微粒的槲皮素。2.MTT检测结果表明Eca-109和Eca-9706的细胞活性抑制率（suppressing rate,SR）依次为LQ2组＞LQ1组＞nLQ组＞对照组,P＜0.05。3.NO细胞化学活性呈蓝色细颗粒分布于胞质内,尤其周缘胞质更明显,其活性从高至低依次为:LQ2组＞LQ1组＞nLQ组＞对照组,P＜0.05。4.羟自由基检测的数值由高至低排列为:LQ2组＞LQ1组＞nLQ组＞对照组,P＜0.05,四组NO细胞化学活性与羟自由基检测的数值之间呈显著正相关,r109=0.956,P＜0.05,r9706=0.957,P＜0.05。5.在人食管癌Eca-109及-9706的对照组细胞中c-met,VEGF,PTEN及cyclinD1的免疫反应性（immunoreactivity,IR）呈棕色细颗粒。cyclin D1-IR及PTEN-IR主要分布于胞核,c-met-IR及VEGF-IR分布于胞质/胞核。c-met及VEGF及cyclin D1的图像扫描灰度均值从高至低为:对照组＞nLQ组＞LQ1组＞LQ2组,P＜0.05。PTEN的图像扫描灰度均值正好相反,从高至低为:LQ2组＞LQ1组＞nLQ组＞对照组,P＜0.05。6.c-met,VEGF,cyclin D1及β-actin的免疫印迹主带分别为c-met,145 kDa;cyclin D1,36kDa;VEGF,21kDa和β-actin,42kDa。各印迹信号的数值为各主带扫描灰度均值与各β-actin扫描灰度均值的比值,从高至低依次为:对照组＞nLQ组＞LQ1组＞LQ2组,P＜0.05。人食管癌Eca-109/9706细胞的PTEN免疫印迹信号扫描灰度均值低下,且呈现＞55kDa的一些突变细条带;各组免疫印迹信号由高至低为:LQ2组＞LQ1组＞nLQ组＞对照组,P＜0.05。四组免疫印迹信号与免疫组化反应性呈正相关,r=0.89～0.95,P＜0.05。结论1.按一定比例的氯仿和DMSO溶解类脂物质制备的脂质体槲皮素的溶解性、均匀性及药效性比按同比例的氯仿和甲醇作为溶剂制备的生物学效应为好。2.LQ2对Ecal09/9706细胞活性抑制率高于LQ1组。3.脂质体槲皮素处理Ecal09/9706细胞48h后,癌细胞的NO活性和羟自由基水平皆增高,两者呈显著正相关。4.脂质体槲皮素以氧化应激为中介有利于逆转Ecal09/9706细胞在低氧条件下诱导产生的c-met及VEGF的过高表达。5.脂质体槲皮素诱导人食管癌细胞逆转化效应主要为通过上调PTEN抑癌基因抑制的PI3k/Akt信号转导途径,而下调cyclin D1的表达。免疫组化与免疫印迹的两者信号之间呈显著正相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 脂质体槲皮素诱导食管癌细胞逆转化及可能机制的研究
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 主要实验试剂及实验仪器
• 3 实验方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附图
• 参考文献
• 综述部分 槲皮素抗肿瘤的研究进展
• 综述正文
• 参考文献
• 英文缩略词
• 后记