论文摘要
背景与目的:血管平滑肌细胞（VSMC）的异常增殖是动脉粥样硬化（As）、经皮冠状动脉介入（PCI）术后再狭窄等的主要病理基础。DNA复制是VSMC增殖的基本特征。起始识别复合物（ORC）是真核细胞DNA复制起始蛋白,其与染色体上的多种复制启动因子协同作用,参与DNA复制的启动。ORC由6个亚单位组成,分别为ORC1～6,其中ORC1是最大的亚基。在G1早期,ORC与DNA的复制起始位点特异结合,形成一个平台,之后Cdc6、Cdt1及Mcm2～7相继结合到ORC-DNA上,形成复制前复合物（pre-RC）。pre-RC在多种蛋白和激酶的作用下活化,促进细胞由G1期进入S期,逐步完成DNA复制。在哺乳动物细胞中,ORC26在细胞周期各阶段均与染色体结合,而ORC1在S期却从核酸上解离下来,直到下一个细胞周期的G1期才重新结合到染色体上,这种ORC1的周期性波动被称为“ORC周期”。可见,ORC1是调节细胞增殖的关键因素。雷帕霉素（rapamycin）是常用的支架涂层药物之一,其抑制VSMC增殖的机制比较复杂,可能是通过磷脂酰肌醇-3/蛋白激酶B （PI3K-AKT-mTOR）通路抑制哺乳类雷帕霉素靶分子（mTOR）从而抑制蛋白质合成,使细胞停留在G0/G1期。本课题在前期研究中发现,siRNA介导的基因沉默抑制ORC1基因表达,能显著抑制VSMC增殖,使细胞停留在G0/G1期。表明:雷帕霉素作用和ORC1基因沉默均使细胞增殖受到抑制。但在细胞周期中,二者发挥作用的时间点哪个更靠前?雷帕霉素作用于VSMC期间,ORC1的表达水平如何变化?尚不清楚。本研究旨在通过SD大鼠胸主动脉取材建立体外VSMC培养体系,探讨雷帕霉素对VSMC增殖的影响、机制及雷帕霉素与ORC1在细胞周期中的作用位点,为进一步探讨As、PCI术后再狭窄等血管增生性疾病的防治措施提供理论依据。方法:（1）用组织块贴壁法进行大鼠VSMC原代培养,采用MTT法检测其吸光度,绘制细胞生长曲线,并确定雷帕霉素对VSMC作用的最佳浓度。（2）细胞随机分为对照组和实验组2组,每组3瓶/孔。对照组VSMC采用含10%FBS的DMEM培养基培养,实验组VSMC采用10μmol/L雷帕霉素+10% FBS的DMEM培养基培养。血清饥饿法饥饿24 h使细胞同步化。采用免疫细胞化学法检测各组作用48 h PCNA、凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白的表达;透射电镜技术分析VSMC超微结构的变化;流式细胞术检测各组细胞周期中G0/G1期、S期、G2期在总细胞中所占百分数的变化;采用Western Blot技术检测各组细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclinA及促凋亡因子P53表达的变化;采用RT-PCR和Western Blot法检测各组ORC1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:（1）体外成功地培养了VSMC,且增殖活性良好。与对照组比较,实验组VSMC采用10μmol/L)雷帕霉素+10% FBS的DMEM培养基培养48 h对细胞增殖有明显的抑制作用（P<0.05）。（2）与对照组比较,实验组培养48 h细胞PCNA阳性表达率明显下降（20±2% vs 80±3%,P<0.05）;P53蛋白的表达逐渐升高（相对光密度值,12 h:38.2±2.4 vs 5.0±2.6, 48 h:70.1±2.9 vs 23.0±2.8,P<0.05）;Bcl-2表达降低（10±5% vs 94±3%,P<0.05）,而Bax表达升高（ 95±2% vs 2±0.5%,P<0.05）,导致Bcl-2/Bax比值降低。（3）电镜检查显示,对照组细胞核边缘不规则,核仁明显,细胞表面突起增多,细胞器丰富,线粒体嵴增多,未见染色质边集现象;而实验组细胞核边缘较规则,细胞表面突起减少,部分染色质边集于核膜下,呈块状或新月状。（4）流式细胞仪检查结果显示,血清饥饿24 h对照组和实验组均主要处于G0/G1期（80.0±0.5% vs 79.9±0.5%）,有少量S期细胞（10.4±0.2% vs 10.0±0.3%）。对照组细胞在10% FBS刺激下,G0/G1期细胞在总细胞中所占百分数逐渐下降（12 h:60.0±0.2%,24 h:55.0±0.3%,48 h:53.0±0.3%）,S期所占比例明显变化（12 h:10.4±0.2%,24 h:31.33±0.3%,48 h:23.3±0.1% ）;实验组细胞在10% FBS刺激下,始终主要处于G0/G1期（12 h:81.3±0.6%,24 h:84.7±0.6%,48 h:85.7±0.1%）,伴少量S期细胞（12 h:8.7±0.2%,24 h:4.8±0.3%,48 h:5.5±0.3%）。与同时间对照组比较,实验组12～48 h G0/G1期细胞所占百分数逐渐升高,而S期、G2期细胞所占百分数逐渐下降,差异有显著性意义（P<0.05）。（5）与同时间对照组比较,12 h和48 h实验组cyclinD1蛋白表达轻微升高（12 h:37.4±0.1 vs 29.3±0.5,48 h:67.2±0.9 vs 52.1±0.8,P>0.05）,cyclinA蛋白的表达明显下降（12 h:80.6±0.7 vs 170.0±0.8,48 h:63.2±0.6 vs 160.2±0.1,P<0.05）。（6）对照组细胞在10% FBS刺激下,ORC1mRNA表达在0～12 h明显升高,24～48明显降低,高峰期在12 h （相对光密度值,0 h :1.2±0.2,12 h:1.1±0.3,24 h:0.6±0.1,48 h:0.3±0.2）。实验组细胞ORC1mRNA的表达始终处于高水平（相对光密度值,0 h :1.2±0.1,12h:1.2±0.2,24h:1.2±0.2,48h:1.1±0.2）。与同时间对照组比较,实验组24 h、48 h ORC1 mRNA的表达明显升高（24 h:1.2±0.2 vs 0.6±0.1,48 h:1.1±0.2 vs 0.3±0.2 ）,差异有显著性意义（P<0.05）。Western Blot结果与之相似。结论:（1）雷帕霉素对VSMC增殖有明显的抑制作用。（2）雷帕霉素不仅抑制VSMC增殖,同时促进其凋亡。（3）雷帕霉素的作用环节可能是通过阻止细胞由G0/G1期→S期转化,诱导细胞处于静止状态。（4）雷帕霉素使VSMC的ORC1始终处于高表达,提示ORC1在细胞周期中的作用环节位于雷帕霉素作用点的上游,进一步支持ORC1参与VSMC DNA复制的启动过程。
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