北柴胡柴胡皂苷合成相关基因的分子克隆与组织表达分析

论文摘要

北柴胡（Bupleurum chinense DC.）为伞形科柴胡属植物,是药用柴胡的主要来源之一,其中所含的主要有效成分柴胡皂苷类是一种齐墩果烷类型的三萜皂苷。目前,国内外对于柴胡皂苷的生物合成研究还很不深入。本文采用改良的trizol方法,成功的提取了北柴胡总RNA,然后以提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法,首次从北柴胡中克隆得到HMGR、IPPI、FPS和β-AS基因—4个柴胡皂苷合成途径中的基因。大小分别为470bp、532bp、466bp、1349bp,分别编码157、177、155、449个氨基酸多肽。对4个基因进行一系列序列分析（NCBI在线BLAST,特征性保守域分析,酶切位点分析,southern杂交分析,分子系统进化树分析）后表明克隆得到了4个基因保守性最强的核心片断。采用RT-PCR方法,在北柴胡中首次克隆得到6个适于实时定量RT-PCR的管家基因片段,片段大小分别为101bp（18S rRNA）、96bp（Cyclophilin）、128bp（EF1α）、121bp（L2）、101bp（β-tubulin）、99bp（Actin）。实时定量RT-PCR试验后,通过CT值定量分析和genorm软件分析18S rRNA、Cyclophilin、EF1α、L2、β-tubulin、Actin基因在北柴胡各器官中表达的稳定性,得出β-tubulin基因是最稳定表达的内参基因,表达最不稳定的是18S rRNA基因。以β-tubulin为内参照,采用实时定量RT-PCR方法扩增,并用2-ΔΔCT相对定量数据分析方法定量HMGR、IPPI、FPS、β-AS基因表达数据,结果显示,在柴胡皂苷合成途径中离终产物最远的HMGR基因和离终产物最近的β-AS基因均在根中表达量最高,根可能为合成柴胡皂苷的主要器官。本试验通过对柴胡皂苷合成相关酶的表达研究证实了北柴胡的各器官都有合成柴胡皂苷的能力,4个皂苷合成相关基因在北柴胡根、茎、叶、花、果实中均有表达,其中IPPI在茎中表达量最高,花中表达量最低;FPS在花中表达量最高,叶子中表达量最低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词对照表
• 1 文献综述
• 1.1 植物次生代谢产物及相关酶的空间特异性分布研究
• 1.1.1 次生代谢与次生代谢产物的概念
• 1.1.2 次生代谢产物的主要类型
• 1.1.3 植物次生代谢产物的功能与其空间特异性分布的关系
• 1.1.4 植物次生代谢相关酶与次生代谢产物空间特异性分布关系
• 1.1.5 次生代谢途径相关酶类的器官、细胞及亚细胞定位研究方法
• 1.2 柴胡皂苷研究
• 1.2.1 柴胡皂苷化学成分及药理作用
• 1.2.2 柴胡皂苷合成相关酶研究进展
• 1.3 实时定量RT-PCR技术及在植物基因表达分析中的应用
• 1.3.1 实时荧光定量PCR技术的原理
• 1.3.2 实时荧光定量PCR数据分析的方法
• 1.3.3 内对照的标准化
• 1.3.4 实时定量RT-PCR在植物基因表达分析中的应用
• 2 柴胡皂苷合成相关基因片段的克隆及基因特性分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 总RNA的提取
• 2.1.3 引物设计及RT-PCR
• 2.1.4 扩增片断的回收
• 2.1.5 目的片段与克隆载体的连接
• 2.1.6 重组质粒的转化与阳性克隆的筛选
• 2.1.7 重组质粒的鉴定
• 2.1.8 柴胡皂苷合成相关基因（HMGR/IPPI/FPS/B-AS）序列分析
• 2.1.9 HMGR基因的拷贝数分析（SOUTHERN BLOT杂交）
• 2.1.10 B-AS基因片断的内含子分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA提取
• 2.2.2 RT-PCR结果
• 2.2.3 重组克隆载体的双酶切与PCR鉴定
• 2.2.4 HMGR基因测序结果及基因特性分析
• 2.2.5 IPPI基因测序结果及序列分析
• 2.2.6 FPS基因测序结果及序列分析
• 2.2.7 B-AS基因测序结果及基因特性分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 实时荧光定量RT-PCR管家基因的克隆及组织稳定性表达
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 总RNA的提取及浓度检测
• 3.1.3 引物设计及RT-PCR
• 3.1.4 扩增片断的回收、连接、转化及阳性克隆的鉴定
• 3.1.5 重组质粒的核苷酸序列测定及比对
• 3.1.6 实时荧光定量RT-PCR
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 6个管家基因RT-PCR结果
• 3.2.2 6个管家基因测序结果
• 3.2.3 核苷酸序列一致性分析
• 3.2.4 6个管家基因REAL TIME PCR扩增曲线、熔解曲线分析
• 3.2.5 6个管家基因RNA转录水平分析
• 3.2.6 6个管家基因的表达稳定性分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 不同组织柴胡皂苷合成相关基因表达分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 总RNA的提取及浓度检测
• 4.1.3 引物设计
• 4.1.4 RT-PCR及扩增产物的测序
• 4.1.5 实时荧光定量RT-PCR
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 HMGR、IPPI、FPS、B-AS基因RT-PCR及测序结果
• 4.2.2 HMGR、IPPI、FPS、B-AS基因REAL TIME PCR扩增曲线、熔解曲线及扩增效率分析
• 4.2.3 北柴胡不同组织HMGR、IPPI、FPS、B-AS基因表达分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 结论
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢