论文摘要
随着糖生物学的迅猛发展，以糖生物学研究为基础的糖药物，包括糖类、糖基化修饰的蛋白质、脂类和化学小分子药物及其和酶相互作用的化合物，已成为新药开发的重要领域。为了探讨糖基化修饰对糖蛋白药物和化学药物生物活性的影响，本课题选用人重组干扰素β（rhIFNβ）、α-Gal（Galα1，3Gal）修饰的表皮生长因子受体HER2的单克隆抗体—α-Gal-Herceptin和新型NO供体半乳糖基化二醇二氮烯翁—β-Ga1-NONO-ate作为研究对象，探讨糖基化修饰的药物分子的作用机理和意义。为新药品的设计和原有药品的改造提供新的思路和理论依据；从而达到增加药物的靶向性、有效地降低药物的毒副作用、使药物在体内表现为最佳活性状态、降低药物的用量和成本等目的。1．rhIFNβ在dhfr--CHO中的高效表达采用PCR技术从pLG104R载体中扩增目的基因，经XhoⅠ和SmaⅠ酶切后克隆到真核表达载体pCI-dhfr中；采用阳离子脂质体介导方法，将构建的表达载体转染到dhfr--CHO细胞中；通过氨甲喋呤（methionine sulphoximine，MTX）加压筛选，以细胞病变抑制（cell pathological effect inhibition，CPEI）法定量检测培养上清中表达产物的生物活性，将高效表达rhIFNβ的CHO细胞株扩大培养；经Blue Sepharose和CM Sepharose柱层析分离纯化，以20％的聚乙二醇（PEG）6000透析浓缩、以夹心ELISA和Western-blotting定量并鉴定表达产物。结果表明，成功地构建了rhIFNβ真核表达载体pCI-dhfr-ifnβ，确定了MTX的最佳筛选浓度为500nmol·L-1，获得了稳定高效表达rhIFNβ的dhfr--CHO细胞株(93×105IU／106cells·mL-1)，纯化浓缩后所得产物的比活性为2.27×107IU·mg-1。为填补我国无自主生产CHO细胞表达的rhIFNβ空白奠定了基础。2．不同表达体系生产的rhIFNβ的生物活性比较采用CPEI和MTT法比较E．coli、Yeast和CHO细胞表达体系所生产的rhIFNβ的体外抗病毒和抗肿瘤活性；以人肺腺癌A549细胞接种的BALB／c裸鼠为实验动物模型，通过瘤重的变化，比较三种不同来源的rhIFNβ对荷瘤小鼠的治疗效果。结果表明，在100ng·mL-1在浓度下，由CHO细胞表达的rhIFNβ，其体外抗病毒活性和抗增值活性显著高于其他两个表达体系；在E.coli、Yeast和CHO细胞表达体系所生产的rhIFNβ对荷瘤小鼠的治疗中，瘤重降低的比率分别是：16％、33.3％和50.6％。因此，rhIFNβ在动物体内的生物活性为：CHO细胞＞Yeast＞E.coli。结果提示，糖蛋白糖形结构越接近天然状态，其生物活性就越高；同时，也显示了以CHO细胞为生产平台表达糖蛋白药物的优越性。3．半乳糖基化NO供体—β-Gal-NONOate的靶向胞内释放及其对肿瘤细胞的抑制作用糖基化是改善化学药物的水溶性、稳定性、靶向性及生物活性的有效手段。以具有β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性的C6／LacZ细胞和无β-半乳糖苷酶活性的C6细胞为体外实验模型，采用Griess法比较β-Gal-NONOate与NONOate分别在C6／LacZ和C6细胞中NO的释放量；通过细胞集落形成、台盼蓝拒染和MTT法比较β-Gal-NONOate与NONOate对上述肿瘤细胞的毒性作用。结果表明，β-Gal-NONOate与C6／Lacz细胞中NO的释放量呈剂量依赖关系，并在相同药物浓度条件下明显高于NONOate（P＜0.01）；然而，在不表达β-半乳糖苷酶的C6细胞中比较稳定；β-Gal-NONOate对C6／Lacz细胞的毒性作用(IC50为5 mmol·L-1)明显高于NONOate(IC50为10 mmol·L-1)P＜0.05)，但对C6细胞则没有明显的抑制作用；NONOate在C6／Lacz和C6细胞中的NO释放量和对这两个细胞系的作用效果都没有显著差异（P＞0.05）。结果提示，β-Gal-NONOate在癌细胞中释放NO和对肿瘤细胞的毒性作用依赖于细胞对β-半乳糖苷酶的表达，因此对表达β-半乳糖苷酶的细胞具有靶向性；而NONOate对细胞是否表达β-半乳糖苷酶没有选择性。4．β-Gal-NONOate对人宫颈癌细胞凋亡的诱导效应的研究采用阳离子脂质体介导法，将真核表达载体pcDNA3-LacZ转染到HeLa细胞中；经G418(400 mg·mL-1)筛选，以5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-Gal）法进行β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性检测，获得稳定表达β-半乳糖苷酶的HeLa／LacZ细胞株；采用LDH法、DNA梯度电泳和形态学观察检测β-Gal-NONOate对HeLa／LacZ细胞凋亡的诱导效应；以MTT法比较β-Gal-NONOate和NONOate对HeLa／LacZ和HeLa细胞的毒性作用。结果表明，β-Gal-NONOate可明显诱导HeLa／LacZ细胞发生凋亡，在0-5 mmol·L-1浓度范围内，呈剂量依赖关系；荧光显微镜观察可见凋亡小体的形成，琼脂糖凝胶电泳可见凋亡典型的DNA梯形条带；MTT结果显示，β-Gal-NONOate(5 mmol·L-1)对HeLa／LacZ细胞的毒性明显高于NONOate（P＜0.05），而对未转染LacZ基因的HeLa细胞的毒性作用与对照相比没有明显差异（P＞0.05）；NONOate对两个细胞系的抑制效应没有显著差异（P＞0.05）。结论β-Gal-NONOate可通过β-半乳糖苷酶的表达诱导HeLa／LacZ细胞的凋亡。5．α-Gal修饰的Herceptin增强人血清对乳腺癌细胞毒性作用的研究以过表达HER2的乳腺癌SK-BR-3细胞为体外实验模型，采用流式细胞术检测由α-Gal-Herceptin介导的anti-Gal与肿瘤细胞的结合率；采用细胞计数法、MTT法和LDH活性测定法，比较α-Gal-Herceptin与Herceptin对SK-BR-3细胞的毒性作用。结果表明，人血清中的α-Gal抗体在α-Gal-Herceptin的引导下，能够特异性地靶向SK-BR-3细胞；当以人血清作为α-Gal抗体和补体来源时，α-Gal-Herceptin通过Hercepti耐癌细胞表面HER2的识别，包被在SK-BR-3细胞表面，增强了癌细胞对人血清的敏感性，即α-Gal-HerceptinN-SK-BR-3细胞的毒性作用明显高于和Herceptin，并成量效关系；但是，在小牛血清中，α-Gal-Herceptin与Herceptin对癌细胞的毒性作用没有明显的差异。综合上述实验结果发现，合理的糖基化修饰不仅可以提高药物的生物学活性，同时，还能够增加药物的靶向性和稳定性。为原有药物的改造和新型药物的设计与开发提供了新的思路和必要的理论依据。