木本植物黄化类植原体的检测鉴定及苦楝丛枝植原体质粒的测定

论文摘要

中国植物种类资源丰富,植原体病害频发,过去被认为由生理性病害造成的许多黄化类病害目前已发现是由植原体引起,有些植原体病害已给林木生产和林业经济带来很大的危害和损失。木本植物黄化类植原体病害与典型的丛枝类植原体病害的很大不同是在被侵染组织内的植原体含量低,给该类植原体的检测鉴定带来了很大困难。通过对黄化类病害的调查、植原体的准确检测及鉴定,从而准确地诊断病害、制定更有针对性的防治措施进而有效的控制此类病害,对农林业生产具有重要意义。本研究采集了北京、四川成都等地的桃树黄化及其它木本黄化类病害样品,用改进的植物总DNA的提取方法,包括利用天根植物基因组试剂盒CB3吸附柱,获得了纯度较高的总DNA;用植原体16Sr DNA通用引物R16mF2/R16mR1未扩增到目的片段,进一步用巢式通用引物R16F2/R16R2从北京颐和园桃树黄化、北京怀柔桃树黄化及北京植物园鼠李黄化病样中检测到植原体的存在,PCR产物序列分析表明他们都属于16Sr I组并和泡桐丛枝植原体有极高的同源性。当用植原体等渗液和差速离心法,先富集植原体,然后提取DNA用于检测时,从怀柔桃树黄化病样中直接扩增到较弱的1.4kb条带,可以确定其被植原体侵染。把黄化桃树接穗嫁接到健康桃树砧木上,未观察到砧木出现典型的叶片黄化症状;嫁接35天和90天后,利用巢式PCR方法也未检测到砧木中存在植原体,而利用带病樱桃组培苗芽嫁接盆栽健康樱桃,成功地将樱桃致死黄化（CLY）植原体传染到健康樱桃中;利用PCR的方法检测了被嫁接樱桃中不同时期、不同部位植原体的分布情况,并利用TaqMan实时定量荧光PCR技术比较测定了被嫁接樱桃树砧木不同部位、组培接穗叶片及根部及田间采集的樱桃致死黄化叶片中的植原体含量,结果表明:离嫁接病芽部位最近的新萌发腋芽、田间病叶、组培苗枝叶和根部都检测到植原体的存在,嫁接部位同侧细根也可能感染植原体,但浓度可能很低,而其他部位皆未检测到植原体存在,其中,离病接穗最近的一个砧木萌芽部位的植原体浓度最高,其次为病组培苗,再次为田间样品,表明新发病的表现严重小叶皱缩症状部位的植原体浓度较高,而组织培养法是保存和繁殖CLY植原体的良好途径。本研究对河南濮阳高新区东干城和小王堌两桃园发生的桃树黄化病进行了调查、采样检测和输液治疗试验,综合植物营养素、四环素治疗情况,两次采样PCR检测结果和果农施肥及施用多效唑等情况,我们分析和判断东干城桃树黄化不是由植原体导致的,很可能是因桃树体内缺少一些营养元素造成的。小王堌桃树黄化病因和东干城桃树黄化病因类似,主要是树体内缺少营养元素（比如缺铁等）造成的,一些桃树植株内也存在的少量病原植原体,但可能不是导致小王堌桃树黄化病害的主要原因。本研究用pPaWBNy-1 ORF4抗血清检测了几种不同植原体侵染的植物材料,Western blot结果表明,在丛枝泡桐中检测到大小为34 KDa的特异性目的条带,并在丛枝泡桐和健康泡桐中检测到一条90 KDa较弱的非特异性条带,该条带可能是和寄主泡桐中的蛋白产生的非特异性反应,海南绿变长春花中检测到两条分别为49 KDa和45 KDa、枣疯病材料中检测到45KDa很弱的非特异性条带,板栗黄化皱缩、樱桃致死黄化和其他健康材料中没有检测到条带。本研究首次测定了我国苦楝丛枝植原体中的一个质粒pCWBFq的完整DNA序列,生物信息学软件预测pCWBFq编码6个蛋白,除了与质粒复制有关的RepA和SSB外,另外4个均为含有疏水结构的分泌蛋白或膜蛋白。对已测定的25个植原体质粒的DNA序列进行相似性比对,结果表明pCWBFq和pPaWBNy-1的相似性最高,为71.02%。对质粒编码的蛋白进行同源性比对,结果显示6个蛋白与来自不同植原体质粒编码的蛋白均具有较高的序列相似性,与pCWBFq P2序列相似性较高的蛋白质并非都是由植原体染色质外DNA编码的,如:AYWB 404是由翠菊黄化丛枝植原体染色质DNA编码的,和pCWBFq P2相似性达91.9%。基于质粒DNA全序列构建系统进化树,pCWBFq与其他16SrI组的质粒聚为一个大的分支,结果与根据16Sr DNA序列构建的系统发育树基本一致。分别对6个ORF的核酸及编码蛋白氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示RepA的系统进化分析结果与基于16S rDNA序列和质粒DNA全序列的系统进化分析结果不一致,不能很好的区分现有的16S组,而ORF2-ORF6的系统进化分析结果与16S rDNA序列系统进化分析结果大体吻合,其中基于ORF3的系统进化分析结果与基于质粒完整序列的系统进化分析结果的一致性较好。用pCWBFq Rep基因序列为模板制备探针进行Southern blot能检测感病苦楝及16SrI组植原体中的质粒,但不能检测16SrV组植原体质粒,包括枣疯、重阳木丛枝、樱桃致死黄化植原体。而且,pCWBFq Rep基因探针还能够检测不同植物和不同地区来源的16SrI组植原体,包括苦楝丛枝植原体福州株系、长春花绿变海南株系及桑树萎缩濮阳株系等存在类似质粒,但质粒条带数目和强弱不同,推断是由于不同寄主来源的植原体甚至同一植原体不同株系的质粒数目和大小存在差异的缘故。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 植原体引起的病害症状类型
• 1.1.2 黄化类植原体病害研究背景
• 1.1.3 苦楝丛枝植原体研究
• 1.1.4 植原体分类研究进展
• 1.1.5 植原体检测技术
• 1.1.6 植原体质粒研究
• 1.1.7 植原体病害的防治
• 1.2 研究目的、研究目标和研究内容
• 1.2.1 研究目的
• 1.2.2 研究目标
• 1.2.3 主要研究内容
• 1.3 研究技术路线
• 1.3.1 木本黄化类植原体的检测及鉴定路线
• 1.3.2 苦楝丛枝植原体质粒测定的技术路线
• 第二章 木本黄化类病害植原体的检测及鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.1.1 木本黄化类病害样品及植原体病害对照样品
• 2.1.1.2 本研究所用抗血清、植物营养素及四环素
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 桃树黄化、樱桃致死黄化及其他黄化类植物的植原体检测
• 2.2.2 桃树黄化和樱桃致死黄化病害嫁接传毒实验
• 2.2.3 樱桃致死黄化病株体内植原体分布及浓度
• 2.2.4 泡桐丛枝植原体质粒ORF4 蛋白抗血清对其它几种植原体的血清学检测
• 2.2.5 泡桐丛枝植原体PaWB tuf 蛋白抗血清对其它几种植原体的血清学检测
• 第三章 苦楝丛枝植原体质粒的测定与序列特征
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 质粒片段的PCR 扩增
• 3.2.2 植原体质粒pCWBFq 和pPeVHn 的序列分析
• 3.2.3 质粒序列相似性及蛋白同源性比较
• 3.2.4 植原体质粒pCWBFq 编码的蛋白质特征
• 3.2.5 质粒DNA 全序列和基因系统进化分析
• 3.2.6 质粒的Southern blot 检测
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 我国不同地区发生的桃树等众多木本植物黄化病的病因
• 4.1.2 关于木本植物黄化类植原体病害的检测
• 4.1.3 樱桃致死黄化植原体组培苗做接穗嫁接健康樱桃传毒成功
• 4.1.4 首次测定了我国福建苦楝丛枝植原体的一个质粒DNA 的完整序列，为质粒结构与功能分析、质粒基因系统进化、植原体检测和鉴定提供了新的信息和手段
• 4.2 讨论
• 4.2.1 木本黄化类植原体症状及检测方法
• 4.2.2 植原体血清学反应与抗原蛋白序列的关系
• 4.2.3 苦楝丛枝植原体质粒
• 4.3 展望
• 参考文献
• 缩写词
• 在读期间的学术研究
• 致谢