低温驯化下黄粉虫抗冻蛋白基因应激表达

论文摘要

黄粉虫在遇到低温时会增高抗冻蛋白的表达,然而抗冻蛋白是一个基因家族,其中蛋白的长度和结构存在着差异。在生物体的适应过程中,哪种抗冻蛋白的基因的表达量更高,尚不清楚。本文就黄粉虫抗冻蛋白基因家族,保守序列长度存在差异的基因进行研究,选取了黄粉虫抗冻蛋白基因家族中三个具有代表性的基因,NCBI数据库编号分别为:AF160497,AF160496,AF160494,进行了实时荧光定量PCR,测定其基因相对表达水平。处理如下,4°C下驯化4天、8天、16天、24后,对上述三个基因的表达量进行了测定,同时还进行了4°C下低温驯化4天、8天、16天、24天,经-11°C处理后,黄粉虫死亡率的统计。此外还进行了抗冻蛋白的在真核细胞SF-9中的表达试验。试验结果表明,随着黄粉虫在4°C下的处理时间延长,经-11°C处理后,黄粉虫的死亡率呈现下降的趋势,4天、8天、16天都有明显的降低,24天处理样本与16天处理样本的差异不显著。黄粉虫4°C下驯化4天、8天、16天,分别取样对基因Af160497进行RTPCR。基因Af160497的表达量,在4天取样点表达量剧烈上升,而到了8天左右表达量则低于4天,经过16天处理后基因的表达量继续增加,总体呈现上升趋势。黄粉虫4°C下驯化4天、8天、16天,分别取样对基因AF160496进行RTPCR。基因AF160496的表达量,在4天取样点有了较大提升,在8天和16天取样现点,它的表达量持续走低。黄粉虫4°C下驯化4天、8天、16天,分别取样对基因AF160494进行RTPCR。基因AF160494的表达量,在4天的取样点也是有了很大提升,在8天取样的点表现出与基因Af160497表达量降低,在16天取样点,该基因又恢复到4天取样点的表达水平。通过对三个基因的对比,基因AF160494的整体表达量高于其他两个处于主导地位,AF160496、AF160497基因表达水平相当,显著低于基因AF160494的表达水平。本研究中,检测了冷驯化对低温死亡率的效应和对不同类型的抗冻蛋白家族成员基因表达量的影响。结果表明,冷驯化可以显著降低黄粉虫幼虫的低温死亡率和提高不同类型抗冻蛋白基因的表达量。其中,长的抗冻蛋白和低温死亡率的相关关系最为明显。说明不同的抗冻蛋白家族成员的功能有明显的分化,为进一步理解抗冻蛋白的活性和利用抗冻蛋白提供了新的认识。真核SF-9细胞表达抗冻蛋白过程中,完成了载体构建及杆粒的形成,并表达出一定蛋白,但得到的蛋白分子量大小与实际存在差异,没有进行深入的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 昆虫抗冻蛋白
• 1.2 昆虫抗冻蛋白的结构特点
• 1.3 抗冻蛋白的活性指标
• 1.4 影响抗冻蛋白活性的因素
• 1.4.1 抗冻蛋白的保守序列的长度
• 1.4.2 抗冻蛋白的TXT 模型
• 1.4.3 抗冻蛋白的存在环境中的其他物质
• 1.4.4 抗冻蛋白的特殊的氨基酸残基
• 1.4.5 抗冻蛋白的热滞活性与盐浓度关系
• 1.4.6 抗冻蛋白互相作用
• 1.5 抗冻蛋白的表达及相应活性的研究
• 1.6 抗冻蛋白双重性
• 1.7 应用与展望
• 1.8 研究意义
• 2 试验材料
• 2.1 材料
• 2.1.1 电泳试剂
• 2.1.2 LB 培养基（100mL）
• 2.1.3 抗生素试剂
• 2.1.4 蛋白纯化用缓冲液
• 2.2 常用仪器
• 2.3 供试虫体
• 3 试验方法
• 3.1 试验步骤
• 3.2 黄粉虫饲养及低温驯化处理
• 3.3 黄粉虫总RNA 提取及反转录
• 3.4 目的基因的获得及新基因的获得
• 3.4.1 引物设计
• 3.4.2 基因克隆
• 3.5 黄粉虫基因家族成员定量分析
• 3.5.1 定量引物的设计
• 3.5.2 定量引物测试
• 3.5.3 定量操作
• 3.6 SF-9 细胞表达抗冻蛋白
• 3.6.1 基本操作流程
• 3.6.2 切口选择及引物设计
• 3.6.3 目的基因改造
• 3.6.4 酶切及环状质粒的构建
• 3.6.5 制备杆粒
• 3.6.6 转染及表达
• 4 试验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士学位论文内容简介及自评