论文摘要
背景组织因子（tissue factor,TF）与动脉粥样硬化血栓形成之间的关系十分密切,他汀类药物被证实具有抗炎、抗氧化及防止血栓形成等独立于降脂以外的多效性,甲羟戊酸（MVA）是胆固醇合成的中间代谢产物,他汀类药物是在竞争抑制胆固醇合成限速酶同时,间接抑制MVA途径中的类异戊二烯等中间产物的合成,而这些中间产物是细胞信号转导及细胞间复杂联系的重要介质,也是Rho等小G蛋白转录后修饰过程中重要的脂质附着分子。他汀类药物对TF表达的影响如何?TF是否经RhoA信号转导通路激活后促进其表达?而他汀类对TF表达的影响是否受RhoA信号转导通路的调控?上述问题均不清楚。我们的研究首先从临床角度证实血浆TF水平对于急性心肌梗死（AMI）患者判断近期临床不良预后的重要意义,然后从TF活性、基因以及蛋白水平观察不同浓度的氟伐他汀（fluvastatin,Flu）对由肿瘤坏死因子-a（TNF-a）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECS）TF表达与RhoA活化的抑制作用,并从蛋白水平探讨其可能的RhoA/Rho激酶通路的调控机制。目的1.研究AMI患者血浆TF水平与C反应蛋白（CRP）、心肌酶（CK-MB）、心功能（LVEF）及相关临床事件等指标之间的关系,探讨血浆TF水平在预测AMI患者临床不良预后方面的意义;2.研究不同浓度Flu对由TNF-a诱导的HUVECs TF含量、活性及TFmRNA表达、TF蛋白水平的影响,探讨他汀类药物在抗血栓形成方面的作用;3.研究RhoA/Rho激酶在氟伐他汀影响TF蛋白表达过程中的调控作用,探讨氟伐他汀在抗动脉粥样硬化血栓形成作用的新靶点。方法1.采用ELISA方法检测AMI患者、稳定型心绞痛（SAP）患者以及健康人血浆TF水平,依据血浆TF水平将AMI患者分为高TF组与低TF组,同时测定CRP、CK-MB、LVEF等指标,随访30天,记录主要心血管事件（心脏性猝死、充血性心力衰竭、非致命性再梗等）的发生率,以TF为自变量,对CRP、CK-MB、LVEF与主要心血管事件等指标进行相关分析;2.将同一簇人脐静脉内皮细胞株进行培养、传代后,分设对照组、TNF-a组、Flu组及干预组（TNF-a+Flu组）,其中TNF-a+Flu组中分别以不同浓度氟伐他汀（0.01,0.1,1,10,100μmol/L）干预,采用ELISA方法测定TF含量,用发色底物法测定TF活性,用RT-PCR方法测定TFmRNA表达水平,用Western-Blot方法测定TF蛋白表达和RhoA的活化水平;对照组、TNF-a+AngⅡ组、AngⅡ组、TNF-a组、TNF-a+Y27632组五组HUVECS,采用Western-Blot方法测定TF蛋白表达水平;3.以SPSS13.0统计软件包进行统计分析,计量资料以均数+标准差（X±S）表示。对主要统计指标均进行正态性分布检验,两组均数间比较采用t检验。以上检验均以P＜0.05为显著性统计学意义。结果1.SAP和AMI组患者TF水平较健康人明显升高[（28.34±17.58）pg╱ml vs（16.73±8.28）pg╱ml;（42.76±25.14）pg╱ml vs（16.73±8.28）pg╱ml,P＜0.05],与SAP比较,AMI组患者TF水平亦明显升高[（42.76±25.14）pg╱ml vs（28.34±17.58）pg╱ml,P＜0.05];在AMI患者中,高TF组主要心血管事件显著高于低TF组（48.4%vs 19.4%,P＜0.05）,Logistic回归分析表明,血浆TF水平与AMI患者心血管事件的发生呈正相关（OR为1.45,P=0.026）;与低TF组比较,高TF组患者CRP[（12.7±5.9）mg╱l vs（9.3±4.9）mg╱l,P＜0.05]、CK-MB[（84.4±30.2）U/Lvs（65.9±29.7）U/L,P＜0.05]显著升高,LVEF显著降低[（34.9±11.4）%vs（51.9±8.9）%,P＜0.05],多元线性回归分析显示,TF与CRP（r=0.702,P＜0.05）、CK-MB（r=0.519,P＜0.05）呈正相关,与LVEF（r=-0.312,P＜0.05）呈负相关;2.TNF-a组TF含量[（9.64±0.58）pg╱ml vs（2.30±0.20）pg╱ml,P＜0.05]及TF活性[（32.56±3.12）pM vs（11.36±0.67）pM,P＜0.05]、TFmRNA表达[（0.88±0.26）vs（0.02±0.01）,P＜0.05]与TF蛋白水平[（0.94±0.32）vs（0.06±0.02）,P＜0.05]较空白组均显著增高;与TNF-a组比较,不同浓度氟伐他汀干预组TF含量与活性以及TFmRNA表达和TF蛋白水平均明显降低,差异有显著性（详见表2—2,P＜0.05）;Flu的抑制作用呈浓度依赖性,Flu在浓度1μmol/L时可显著抑制由TNF-a诱导的TF水平及活性[（4.99±0.24）pg╱ml vs（9.64±0.58）pg╱ml,（20.27±1.26）pg╱ml vs（32.56±3.12）pM,P＜0.05],继续升高Flu浓度,作用无显著差异（P＞0.05）。3.TNF-a在诱导HUVECSTF表达的同时,可使RhoA活化,氟伐他汀可抑制RhoA活化;AngⅡ（RhoA激酶激动剂）可促进TNF-a诱导的HUVECSTF蛋白表达水平,而Y27632（RhoA激酶抑制剂）可抑制TNF-a诱导的HUVECSTF蛋白表达水平。结论1.TF是参与动脉粥样硬化破裂斑块血栓形成的关键因素,血浆TF水平的变化与AMI患者炎症、病变范围与严重程度呈正相关,早期测定血浆TF可以作为AMI患者判断未来心血管事件等不良预后的一个可行的预测因子;2.氟伐他汀可有效抑制由TNF-a诱导的人脐静脉内皮细胞TF含量、活性和基因以及蛋白表达水平,提示氟伐他汀具有潜在的降脂之外的抗动脉血栓作用;3.氟伐他汀对TF表达的抑制作用可能是通过小G蛋白水平上的RhoA/Rho信号调控通路参与其调控机制。