粉末链霉菌KR4突变体的构建及产物分析

论文摘要

Fostriecin（福司曲星,FST）及其衍生物是一类很有价值的聚酮化合物,具有广谱的抗肿瘤活性。对FST结构经常进行化学修饰步骤繁琐,而且易引起环境污染,所以探索基因工程途径改造FST的合成过程,可为新型抗生素的研发开辟新的途径。首先,本实验利用pSETl52载体建立了FST产生菌的转化体系。通过对PEG介导的原生质体转化,接合转移和电转化三种转化方法比较,我们发现接合转移对FST产生菌进行基因工程操作更适合,同时使用含一定浓度的Mg2+,Ca2+和甘氨酸的MS培养基会大大提高FST产生菌与大肠杆菌属间的接合转移效率,并显著加速转化子的生长。对红霉素组合生物合成技术的研究中发现,位于红霉素PKS中的KR6结构域Tyr2699是关键性氨基酸残基,同时我们在对FST的合成酶KR4酶结构域与人、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的谷胱甘肽还原酶氨基酸序列比对时,发现KR4酶域有一个相类似的指纹区域,是与NADPH的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸部分结合部位,FST的侧链上C-11位功能基团-OH是由其聚酮合成酶（polyketidesynthase, PKS）模块4中的酮基还原酶（keoterudcates,KR）酶域决定,所以可以利用基因工程的方法改造KR4酶域的DNA序列,使KR4酶域失活。本文通过同源重组方法在粉末链霉菌中突变了KR4酶域中指纹区域的第一个Gly密码子和与红霉素KR6催化位点Tyr2699相对应的KR4中的Tyr密码子,获得了C-11含酮基的FST突变株,以粉末链霉菌基因组DNA为模板,用PCR技术扩增出KR4及两侧DNA片段。克隆到载体pUC19上,然后利用PCR介导的部分互补引物定点突变方法将KR4中的Tyr（Y）TAC换成Thr（T）密码子ACC, Gly（G）GGC换成Ala（A）GCG。并克隆到pOJ260质粒上,构建了同源重组质粒pOJTA,利用接合转移方法将pOJTA转入粉末链霉菌,并整合于染色体FST合成基因位点。筛选出的整合体FZ在ISP2培养基上生长至少5代后,挑出不能在Apramycin抗性平板上生长但是可在空ISP2培养基上生长的突变菌株FM。PCR和部分基因组DNA序列分析表明突变菌株粉末链霉菌FM染色体上KR4酶域相应位点发生了突变,但摇瓶发酵产物的HPLC分析结果表明：突变株没有检测到11-酮基的FST。分析其原因可能是目标产物量太少,无法检测到信号或者是TE酶对其不能识别脂肪侧链或者是两个氨基酸位点的改变影响了整个聚酮合酶的活性。以上研究结果为研究FST生物合成酶的特征,以及进一步利用组合生物合成技术合成FST类似物奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 癌症及其治疗现状
• 1.2 聚酮化合物
• 1.2.1 聚酮化合物简介
• 1.2.2 聚酮化合物分类
• 1.2.3 聚酮化合物合成酶
• 1.2.4 Ⅰ型聚酮化合物合成酶
• 1.3 组合生物合成
• 1.3.1 组合生物合成概念
• 1.3.2 组合生物合成的原理以及优点
• 1.3.3 组合生物合成在PKS中的应用
• 1.4 Fostriecin的研究
• 1.4.1 天然产物Fostriecin类化合物的简介
• 1.4.2 Fostriecin的生物作用机制
• 1.4.3 FST全合成简介
• 1.4.4 FST的生物合成介绍
• 1.4.5 Fostriecin后修饰基因功能预测
• 1.5 红霉素中KR的研究
• 1.6 题依据和主要内容
• 1.6.1 立题依据
• 1.6.2 主要内容
• 2 FST产生菌基因导入系统建立和条件优化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 质粒和载体
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 实验所用试剂和试剂盒
• 2.2.4 本实验所用仪器
• 2.2.5 本实验过程培养基
• 2.2.6 主要溶液
• 2.2.7 抗生素及氨基酸
• 2.2.8 溶菌酶、蛋白酶K溶液的配制
• 2.2.9 工具酶
• 2.2.10 其它药品及生化试剂
• 2.2.11 PCR引物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 大肠杆菌质粒的小量提取（SDS碱裂解法制备）
• 2.3.2 粉末链霉菌总DNA的小量提取制备
• 2.3.3 粉末链霉菌总DNA的大量提取
• 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.5 大肠杆菌质粒转化
• 2.3.6 DNA片段的琼脂糖凝胶回收纯化
• 2.3.7 限制性单酶切和双酶切体系
• 2.3.8 目的基因与不同载体的连接
• 2.3.9 大肠杆菌菌种的保藏
• 2.3.10 粉末链霉菌孢子悬液的制备
• 2.3.11 PCR反应体系建立及步骤
• 2.3.12 粉末链霉菌原生质体的制备,再生和转化
• 2.3.13 大肠杆菌—链霉菌属间接合转移系统的建立
• 2.3.14 链霉菌孢子的电击转化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 三种基因导入方法的比较
• 2.4.1.1 利用接合转移法试验pSET152空载体的转化
• 2.4.1.2 利用PEG-介导粉末链霉菌原生质体转化
• 2.4.1.3 电转化
• 2.4.2 接合转移转化方法的条件优化
• 2.5 本章小结
• 3 粉末链霉菌酮基还原酶突变体的构建
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 质粒和载体
• 3.2.3 主要仪器及设备
• 3.2.4 主要生化试剂
• 3.2.5 培养基
• 3.2.6 主要溶液
• 3.2.7 抗生素及氨基酸
• 3.2.8 工具酶、溶菌酶溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化
• 3.3.2 其它实验
• 3.3.3 大肠杆菌与链霉菌之间的属间接合转移
• 3.3.4 基因定点突变
• 3.3.5 点杂交
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 同源性比较
• 3.4.2 pUCYG质粒的构建
• 3.4.3 突变引物设计和突变载体构建
• 3.4.4 重组载体pOJTA的构建及鉴定
• 3.4.5 pOJTA质粒转化及粉末链霉菌染色体整合体的筛选,鉴定
• 3.4.6 粉末链霉菌突变菌株FM的筛选
• 3.5 本章小结
• 4 突变体发酵产物分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 主要仪器及设备
• 4.2.3 主要生化试剂
• 4.2.4 主要溶液
• 4.2.5 主要培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 FST及类似物发酵工艺条件
• 4.3.2 FST的生成曲线
• 4.3.3 FST及其类似物的分析方法
• 4.3.4 Fostriecin及衍生物紫外吸收及保留时间的确定
• 4.3.5 柱层析方法
• 4.3.6 FST制备
• 4.4 结果分析
• 4.4.1 FST生成曲线
• 4.4.2 Fostriecin及类似物的紫外吸收及保留时间确定
• 4.4.3 突变菌株FM发酵产物HPLC分析
• 4.5 本章小结
• 讨论与总结
• 参考文献
• 附录A Fostriecin电喷雾电离质谱图（ESI-MS）
• 1H NMR谱图'>附录B Fostriecin ¹H NMR谱图
• 附录C1 pUCTA质粒中外源突变片段测序图谱（正向）
• 附录C2 pUCTA质粒中外源突变片段测序图谱（正向）
• 附录C3 pUCTA质粒中外源突变片段测序图谱（反向）
• 附录C4 pUCTA质粒中外源突变片段测序图谱（正向）
• 附录C5 pUCTA质粒中外源突变片段测序图谱（反向）
• 附录D1 突变菌株中突变位点M2测序图谱
• 附录D2 突变菌株中突变位点M1测序图谱
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢