论文摘要
阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD）是最为常见的引起老年痴呆的脑部神经退行性疾病,临床症状表现主要为记忆丧失,认知障碍,行为异常等,其中海马区是AD病程中脑内最先受损的区域。随年龄增加引起的衰老／老化是引起阿尔茨海默症的最为重要的风险因素。AD患者脑中的主要病理学改变是存在广泛的老年斑和神经纤维缠结。APP的异常剪接产生了Ap蛋白,而Ap的沉积作用引起老年斑的形成,Ap的毒性作用被认为与AD的发生发展直接相关。Tau蛋白高度磷酸化造成神经纤维退化及功能丧失,形成双股螺旋神经丝和神经纤维缠结。MicroRNA （miRNA）是一类内源性的大小在20-25nt的一类非编码RNAs,主要通过与靶基因的3’UTR结合完全互补或不完全匹配,降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译,发挥调控作用。人类有接近1/3的基因受到niRNA的调控。根据目前的大量研究表明,miRNA参与生命活动的各项重要过程。miRNA与细胞的衰老、凋亡、细胞命运决定及老化过程都存在着密切的关系；miRNA的异常表达可能引起疾病乃至肿瘤的发生。目前,发现很多miRNA与神经退行性疾病相关。本研究选用了自然筛选的存在学习记忆障碍的早老痴呆模型小鼠——SAMP8小鼠为研究模型,开展工作。其对照小鼠为正常衰老的SAMR1小鼠。SAMP8小鼠主要表现为增龄过程中,中枢学习记忆功能快速衰退,且中枢神经系统如皮质、海马等部位存在与AD类似的病理变化,如APP含量升高及淀粉样蛋白Aβ沉积,是目前国际上普遍认可并采用的老化痴呆相关动物模型。本研究首先检测了SAMP8和SAMR1小鼠海马组织中,APP mRNA水平和蛋白水平随月龄的变化,发现正常小鼠与痴呆模型小鼠相比,APP蛋白水平在4,8,12-月龄的SAMP8小鼠中表达显著增高,与其mRNA的水平变化趋势不一致,提示可能存在转录后调控。通过对APP 3’UTR生物信息学预测、Real-time PCR验证以及双荧光素酶报告基因试验发现miR-16能够结合于APP 3’UTR,并显著下调荧光素酶的活性,转染miR-16的抑制物能够使荧光素酶活性显著增高,并验证了生物信息学预测的miR-16与APP 3’UTR的结合位点为真性结合位点。在N2a细胞和NIH3T3细胞中,过表达miR-16后,利用western blot实验发现APP蛋白表达水平下调；利用脑立体定位注射技术,将miR-16的模拟物注射入脑室,发现体内过表达miR-16能够下调APP蛋白表达水平。通过原位杂交、免疫组织化学试验,发现在SAM小鼠中,miR-16与APP蛋白的空间表达存在互补。在正常的神经发育过程中,miR-16和APP的表达量和表达部位也分别体现出了很好的协调与互补性。证明miR-16可能通过调控AD发病过程中的关键蛋白APP与AD的病理机制相关。为了进一步阐释miRNA与老化和AD进程的关系,发现更多在老化与AD过程中,可能引起学习记忆功能障碍的相关miRNA。我们利用miRNA芯片高通量筛选了在4,8,12-月龄中SAMP8小鼠相比同月龄SAMR1小鼠海马组织中具有显著表达差异的niRNA,并得到了相应差异表达miRNA的数据。经过Real-time PCR、原位杂交等的验证和过滤,通过对部分差异表达miRNA的初步功能筛选和验证,我们选择三个月龄之间均有表达差异的miR-9*,和与之来自于同一前体的miR-9作为首选研究对象,对其靶基因进行了预测验证,发现miR-9能够靶向MAPK信号通路中的关键蛋白MAP3K3的3’UTR, miR-9*能够靶向细胞周期抑制因子CDKnlc的3’UTR。以上工作,为发现在老化和AD进程中影响学习记忆和认知功能的关键miRNA,建立miRNA和靶基因的调控网络提供了新的基础。