甜樱桃果实中五个乙烯信号转导基因的克隆及其表达

论文摘要

乙烯作为一种内源性植物激素,对植物的生长发育有着重要影响。目前,乙烯信号转导途径及其调控机理已成为果实成熟分子生物学的研究热点。本文比较了GenBank中已登录的多种植物的EIN2、EIN3/EIL、EBF基因的氨基酸序列和核苷酸序列,根据保守序列设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术,从甜樱桃（Prunus avium L.）中克隆了甜樱桃PacEIN2、PacEILs和PacEBF1基因的cDNA序列。结果表明,PacEIN2 cDNA全长4 278 bp,包含一个3 864 bp的开放阅读框,编码1287个氨基酸,5’端非编码区和3’端非编码区分别为173 bp、241 bp,推测其蛋白质分子量为139.44 kDa,等电点为5.74。PacEIL1全长2 636 bp,包含一个1 806 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸,5’端非编码区和3’端非编码区分别为321 bp、509 bp,推测其蛋白质分子量为67.84 kDa,等电点为5.50。PacEIL2全长2 109 bp,包含一个1 806 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸5’端非编码区和3’端非编码区分别为140 bp、163 bp,推测其蛋白质分子量为为67.27 kDa,等电点为5.65。采用RACE及相关技术克隆得到PacEIL3的大部分序列,大小为2 080 bp。PacEBF1全长3 120 bp,包含一个1 941 bp的开放阅读框,编码646个氨基酸,5’端非编码区和3’端非编码区分别为249 bp、930 bp,编码蛋白的分子量为68.87 kDa,等电点为7.12。利用荧光定量PCR技术分析了4个乙烯信号转导元件基因的表达特性,结果显示在红灯和早大果两个品种中,PacEIN2,PacEIL2,PacEIL3和PacEBF1在不同组织和果实不同成熟期均有表达但表达模式不同。不同组织中,PacEIN2,PacEIL2,PacEIL3和PacEBF1在幼叶、幼果中表达量较高,而在老叶和完熟果实中表达量较低;在甜樱桃果实不同成熟期,PacEIN2,PacEIL2,PacEIL3和PacEBF1在果实始熟前期表达量较高,后期呈下降趋势,初步结果表明乙烯可能不参与甜樱桃果实后熟及衰老进程。这些研究可以为更深入地了解乙烯信号转导途径和甜樱桃果实成熟衰老的控制提供更为科学的依据。

论文目录

• 英文缩写符合及其中英文对照表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 乙烯与果实成熟衰老
• 1.2 乙烯信号转导研究进展
• 1.2.1 拟南芥乙烯信号转导研究进展
• 1.2.1.1 乙烯受体基因家族及其分类
• 1.2.1.2 CTR1
• 1.2.1.3 EIN2 和ETP
• 1.2.1.4 EIN3（EILs）和EBF
• 1.2.1.5 ERF（EREBP）
• 1.2.2 番茄等果实的乙烯信号转导研究进展
• 1.3 本论文研究的目的与内容
• 1.3.1 本论文研究的目的
• 1.3.2 本论文研究的内容
• 1.4 本论文研究的创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料与试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用试剂配制
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 提取
• 2.2.1.1 甜樱桃果实总RNA 提取
• 2.2.1.2 花和叶片中总RNA 提取
• 2.2.2 核酸质量及浓度测定
• 2.2.3 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.3 cDNA 全长序列的获得
• 2.3.1 PacEIN2 基因的扩增条件和程序
• 2.3.2 PacEILs 基因的扩增条件和程序
• 2.3.2.1 PacEIL1 的5’端cDNA 序列扩增
• 2.3.2.2 PacEIL2 的5’端cDNA 序列扩增
• 2.3.2.3 PacEIL3 序列的克隆
• 2.3.3 PacEBF1 基因的扩增条件和程序
• 2.3.3.1 PacEBF1 的中间序列片段的克隆
• 2.3.3.2 PacEBF1 的3’端cDNA 序列扩增
• 2.3.3.3 PacEBF1 的5’端cDNA 序列扩增
• 2.3.4 PCR 产物的克隆
• 2.3.4.1 重组质粒的转化及鉴定
• 2.3.4.2 PCR 产物的回收和纯化
• 2.3.4.3 DNA 序列测定
• 2.4 荧光定量PCR 分析不同时期和组织的表达量
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 反转录反应（RT）
• 2.4.3 Real Time PCR 反应
• 3 结果与分析
• 3.1 PacEIN2 的cDNA 克隆与序列分析
• 3.1.1 PacEIN2 保守区序列的扩增
• 3.1.2 PacEIN2 的全长cDNA 克隆
• 3.1.3 PacEIN2 的序列分析
• 3.2 PacEILs 的 cDNA 克隆与序列分析
• 3.2.1 PacEILs 的cDNA 克隆
• 3.2.2 PacEILs 的序列分析
• 3.3 PacEBF1 的cDNA 克隆与序列分析
• 3.3.1 PacEBF1 的cDNA 克隆
• 3.3.2 PacEBF1 的序列分析
• 3.3.3 PacEBF1 与其它EBF 基因的聚类分析
• 3.4 四个乙烯信号转导基因在果实和叶片中的表达分析
• 3.4.1 四个基因在红灯和早大果两个品种不同组织中的表达
• 3.4.2 四个基因在红灯和早大果两个品种不同果实成熟期中的表达
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作的展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文
• 硕士学位论文内容简介及自评