聚羟基丁酸—羟基己酸酯在血管组织工程中的应用研究

论文摘要

本研究以聚羟基脂肪酸酯家族中的新成员聚羟基丁酸-羟基己酸酯（PHBHHx）为基础,分别从血液、细胞、组织三个层次深入研究其用于血管组织工程中的潜能。同时,以氨等离子处理后纤连蛋白（Fn）锚定或与聚乙二醇（PEG）共混等方法对其进行改性,为进一步利用PHBHHx构建多层复合血管支架提供了坚实的应用基础。其研究结果概括如下:1.体外测试证实PHBHHx引起溶血率仅有3%,低于PHB的5%及PHBV的8%,且3-羟基己酸（3HHx）含量为12%的PHBHHx膜上血小板粘附量少,能保持正常形态,说明PHBHHx有较好的血液相容性。2.脐静脉血管内皮（HUVECs）、人脐动脉平滑肌（HuSMCs）、兔主动脉平滑肌（RaSMCs）细胞分别在3HHx含量为20%、12%、20%的PHBHHx膜上代谢活性最高,且与细胞培养板上的对照细胞代谢活性持平,其变化呈现一定的3HHx含量依赖型。3.RaSMCs在3HHx含量为20%的PHBHHx膜上培养6天后,胞内α-actin呈束状收缩分布,表达量为对照细胞的200%,证实其由合成型表型转向收缩表型,从而首次揭示该材料潜在的对平滑肌细胞分化的诱导功能,同时因其有利于平滑肌的有限增殖而可用作多层复合血管支架的中层及外层基材。4.氨等离子处理后采用纤连蛋白（Fn）锚定的PHBHHx膜（PFn-PHBHHx）,能支持104/cm2的HUVECs在72小时内快速生长至融合。RaSMCs则能在PEG/PHBHHx比例为1:1的共混膜（E1X1）上持续增殖至融合,但是HUVECs则呈粘附较差的类球形形貌,由此PFn-PHBHHx及E1X1可分别用于制备多层复合血管支架的内膜及近内膜基材。5.兔皮下植入PHBHHx仅引起非常温和的组织反应,表现为6个月后,材料外包囊组织仅有约50μm的几层疏松结缔组织及静止的成纤维细胞组成,整个植入过程未见有任何炎性细胞。在兔体内PHBHHx的降解速度快于PHB,呈典型的无定形区键断裂速度快于结晶区的降解方式,而PHB为任意键断裂,从而揭示两者在动物体内降解机制上的差异,为拓展其在组织工程中的应用奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 血管组织工程概述
• 1.1.1 血管组织工程的要求及研究进展
• 1.1.2 血管支架材料
• 1.1.3 细胞植入
• 1.1.4 提高细胞在基质材料上的粘附
• 1.1.5 生物移植物的组织工程化
• 1.1.6 组织工程血管移植物发展中存在的问题及展望
• 1.2 聚羟基脂肪酸酯（PHAs）在组织工程中的应用
• 1.2.1 聚羟基脂肪酸酯（PHAs）概述
• 1.2.2 PHAs 的物化性质
• 1.2.3 PHAs 的生物相容性
• 1.2.4 PHAs 在体内的自然分布
• 1.2.5 体内生物吸收性
• 1.2.6 PHAs 在心血管组织工程中的应用
• 1.3 论文的目的及意义
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 测试样品制备及物理性能测试
• 2.1.1 PHA，PLA 以及PHBHHx/PEG 共混膜的制备
• 2.1.2 PHBHHx 膜的表面修饰
• 2.1.3 衰减全反射（ATR）－傅立叶变换红外光谱（FTIR）
• 2.1.4 X 射线光电子能谱法
• 2.1.5 示差扫描量热法（DSC）
• 2.1.6 样品接触角测量和表面自由能
• 2.1.7 重量损失
• 2.1.8 分子量测定
• 2.2 血液相容性体外测定
• 2.2.1 溶血率测定
• 2.2.2 血小板粘附观察
• 2.3 血管相关细胞亲和性测定
• 2.3.1 药品及试剂
• 2.3.2 常用仪器设备
• 2.3.3 常用溶液
• 2.3.4 常用手术器械
• 2.3.5 脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）的分离和培养
• 2.3.6 脐静脉血管内皮细胞VIII 相关原表达检测
• 2.3.7 人脐动脉平滑肌细胞（HuSMCs）的分离和培养
• 2.3.8 兔主动脉平滑肌细胞（RaSMCs）的培养
• 2.3.9 细胞接种
• 2.3.10 扫描电镜（SEM）观察和碘化吡啶（PI）染色
• 2.3.11 MTT 法测定细胞代谢活性
• 2.3.12 流式细胞仪测定细胞周期
• 2.3.13 共聚焦显微镜观察特征分子表达
• 2.3.14 酶联免疫法（Elisa）测定吸附纤连蛋白含量
• 2.3.15 蛋白印记法测定平滑肌细胞内α-肌动蛋白的表达
• 2.4 材料体内植入及组织学观察
• 2.4.1 实验动物
• 2.4.2 兔皮下植入待测材料及组织学观察
• 2.4.3 苏木精－伊红（HE）染色
• 2.5 统计学方法
• 第3章 PHBHHx及相关材料血液相容性体外研究
• 3.1 溶血率测定
• 3.2 血小板粘附
• 3.3 材料表面理化特性
• 3.3.1 材料表面形貌
• 3.3.2 衰减全反射（ATR）－傅立叶变换红外光谱（FTIR）
• 3.3.3 表面水接触角测定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 PHBHHx 与血管相关细胞亲和性研究
• 4.1 PHBHHx 膜材与脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）的亲和性
• 4.1.1 HUVECs 的分离与鉴定
• 4.1.2 HUVECs 在测试膜上的代谢活性
• 4.1.3 HUVECs 在测试膜上的生长形貌
• 4.2 血管平滑肌细胞与PHBHHx 膜的亲和性
• 4.2.1 人脐动脉平滑肌（HuSMCs）细胞在测试膜上的粘附及增殖
• 4.2.2 兔主动脉平滑肌细胞在PHBHHx 膜上的粘附及增殖
• 4.2.3 RaSMCs 在PHBHHx 膜上的细胞周期变化
• 4.2.4 RaSMCs 细胞在PHBHHx 膜上α-肌动蛋白的分布及表达
• 4.3 测试膜材的理化特性
• 4.3.1 X-射线光电子能谱分析膜表面化学状态（XPS）
• 4.3.2 测试膜表面亲疏水性分析
• 4.3.3 测试膜热性质分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第5章 PHBHHx 膜的生物化修饰研究
• 5.1 生物化修饰的PHBHHx 膜材理化特性
• 5.1.1 X－射线光电子能谱分析表面化学状态
• 5.1.2 表面改性的PHBHHX 膜的水接触角和表面能
• 5.2 血管相关细胞与生物化修饰膜的亲合性
• 5.2.1 血管相关细胞在生物化修饰膜上的粘附及增殖
• 5.2.2 血管相关细胞在生物化修饰膜上的分布及形貌
• 5.2.3 Fn 与纤维形肌动蛋白（F－actin）共定位观察
• 5.3 生物化修饰的PHBHHx 膜上Fn 的吸附
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第6章 PEG 对PHBHHx 的共混改性研究
• 6.1 共混材料表面物化特性研究
• 6.1.1 衰减全反射（ATR）－傅立叶变换红外光谱（FTIR）
• 6.1.2 X－射线光电子能谱
• 6.1.3 共混膜的亲水性及表面自由能
• 6.1.4 共混膜的热力学性质
• 6.2 共混材料的细胞亲和性研究
• 6.2.1 血管相关细胞的代谢活性
• 6.2.2 血管相关细胞在共混膜上的生长形貌
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第7章 PHBHHx 的体内生物降解研究
• 7.1 植入PHBHHx 相关材料的重量损失研究
• 7.2 植入材料的分子量损失研究
• 7.3 植入材料的热力学性质变化研究
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 第8章 PHBHHx 相关材料体内组织相容性研究
• 8.1 取出材料的物理形貌观察
• 8.2 材料周围包囊的组织学观察
• 8.2.1 取出PHBHHx 材料周围包囊的组织学观察
• 8.2.2 取出PHB 材料周围包囊的组织学观察
• 8.2.3 取出PLA 材料周围包囊的组织学观察
• 8.2.4 取出PHBHHx/PEG 共混膜周围包囊的组织学观察
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 第9章 结论
• 9.1 总结
• 9.2 需要进一步开展的工作
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 论文部分缩略词表
• 个人简历、在学期间发表的学术论文