依那西普减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制研究

论文摘要

实验背景血管再通对于缺血性心脏病的治疗具有重要意义，但往往伴随心肌缺血再灌注（MI/R）损伤，其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是介导再灌注损伤的最重要分子之一。脂联素（APN）是由脂肪细胞分泌的细胞因子。在MI/R过程中，发挥抗炎、抗心肌缺血损伤的作用，但MI/R损伤可导致APN含量的显著抑制。既往实验证实，脂肪细胞中TNF-α可显著抑制脂联素mRNA及蛋白的表达。长期给予依那西普阻断TNF-α可以提高Ⅱ型糖尿病患者血浆脂联素的含量。然而，在缺血再灌注急性期，TNF-α水平的升高是否为脂联素表达被抑制的原因？此时给予抗TNF-α的中和蛋白依那西普能否提高脂联素的水平进而发挥心肌保护作用？目前仍未见报道。实验目的1.观察MI/R时单次注射依那西普（一种已在临床使用的抗TNF-α中和蛋白）能否阻断血浆TNF-α升高，并发挥抗MI/R损伤的作用。2.观察在MI/R时阻断血浆TNF-α，可否提高血浆APN水平。3.研究阻断TNF-α发挥的抗MI/R损伤的作用是否与干预APN表达水平有关。实验方法1.建立小鼠MI/R模型：使用异氟烷麻醉剂吸入法麻醉小鼠后，从小鼠左侧第四肋间穿透胸膜，纵膈并暴露心脏，用丝线在小鼠冠状动脉左前降支距主动脉根部处打一个活结，随后挤压左侧胸廓以减轻肺部气胸，最后缝合手术伤口。在缺血20min时，对照组给予盐水，实验组给予依那西普5mg/kg腹腔治疗。在缺血30min后，开活结行再灌注。2.建立小鼠APN R1+R2受体siRNA干扰模型：使用异氟烷吸入麻醉小鼠后，从小鼠左侧第四肋间穿透胸膜，纵膈并暴露心脏。使用In Vivo Jet PEI试剂与购买的针对脂联素受体1和受体2的siRNA混和，在小鼠心脏左室游离壁分三个点进行注射，随后挤压左侧胸廓减轻肺部气胸，最后缝合手术伤口。通过Western blot检测脂联素受体1和受体2表达水平，发现48小时后siRNA干扰效率最高。选取siRNA注射48h后的小鼠进行MI/R模型制备，治疗干预同前。3.在上述模型构建完成后，分别检测下列指标：1)小鼠喂养至2周，分别在MI/R后1，7，14天通过小动物超声检测心脏LVEF。在MI/R后1，3，8小时，1，3，5，7，14天通过眼眶静脉取血，通过ELISA法检测小鼠血浆TNF-α与APN含量。2)小鼠在MI/R后1天通过颈动脉插管检测心脏LVEDP，±LV dp/dt，随后取心脏，通过Evansblue/TTC染色检测心脏梗死面积。3)小鼠在MI/R后3小时，取心肌进行TUNEL染色和测定Caspase-3活性以观察小鼠心肌细胞凋亡情况。实验结果1.发现注射依那西普能够显著中和MI/R后升高的血浆TNF-α。证实依那西普能够提高小鼠LVEF，减少心肌梗死面积，减少心肌细胞TUNEL阳性率，降低Caspase-3活性，说明依那西普可以有效阻断TNF-α并发挥了抗MI/R损伤的作用。2.在siRNA干扰小鼠中，通过Western blot法检测脂联素受体1和受体2表达水平，发现脂联素受体1和受体2表达下降了60-70%，证实siRNA干扰模型建立成功。3.发现注射依那西普能够显著提高MI/R后被抑制的血浆APN水平。在脂联素受体1和受体2干扰的小鼠中，依那西普虽仍可提高血浆APN水平，但其减少心肌梗死面积，减少细胞凋亡的心肌保护能力被减弱。结论抗TNF-α的中和蛋白依那西普阻断TNF-α可逆转MI/R后血浆APN的降低，并发挥心肌保护作用。提示依那西普发挥的心肌保护作用可能部分通过提高APN实现。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 1. MI/R 损伤
• 2. 脂联素
• 3. TNF-α
• 第一部分 观察依那西普对小鼠 MI/R 损伤的保护作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 构建心肌脂联素受体 1 和受体 2SIRNA 干扰小鼠模型
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 利用SIRNA干扰小鼠模型研究MI/R时依那西普治疗对脂联素含量的影响及意义
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢