论文摘要
一、背景深Ⅱ°烧伤创面是临床治疗的难点之一,目前临床多采用创面换药治疗,但换药通常需要3-4周甚至更长时间,不仅换药周期长,而且愈合质量差。烧伤创面的愈合包括炎症反应、细胞增殖和组织塑型等病理生理过程,其中生长因子起着重要的调控作用。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）在创面愈合过程中通过多种作用机制对皮下组织、真皮和表皮细胞增殖与修复起明显的促进作用,在深Ⅱ度烧伤创面有效使用碱性成纤维细胞生长因子可提高愈合速度和改善愈合质量。目前局部喷、敷生长因子溶液的方法在实际应用中未发挥其最佳效果,面临着各种问题,如生物利用度低、易被降解破坏、渗透性有限等。对创面组织直接转基因理论上讲是合理可行的,基因疗法至少应当充分考虑两方面的问题:第一是将所需目的基因导入靶细胞时不能对机体造成损害或损害轻微;第二是要有达到疗效所需的足够的靶细胞转染率。目前常用的转基因方法如脂质体或病毒转基因存在种种问题,最主要的是转基因效率低、操作复杂、缺乏安全性等。近年新发展起来的微粒轰击转基因技术是将载有DNA的质粒在钙离子的参与下吸附于金粒,然后借助于基因枪（gene gun）的特殊装置通过氦气驱动使之高速攻击培养的细胞、活体体表或其他暴露的组织,金粒借助高速产生的冲击力穿过细胞膜进入胞内。在细胞内,吸附于金粒的DNA可游离,进而表达其编码的蛋白。由于体内外的研究均未发现金粒对细胞的毒性作用,而且金粒的直径极小（直径1-3μm）,不会对细胞造成损伤。该方法不仅方便、高效,而且相当安全。由于该技术的特点,对于培养的细胞或浅表部位的转基因尤其适用,这对烧伤治疗有其独特的应用价值。二、目的将已经构建好的人bFGF真核表达载体pCI-neo-bFGF,通过基因枪转染技术,对SD大鼠深Ⅱ度烧伤创面进行转基因。通过对创面愈合指标进行评价,评判基因枪转生长因子基因技术治疗深Ⅱ°烧伤创面的效果和可行性。三、实验方法本实验分三部分进行:第一部分:将已经构建好的bFGF真核表达载体大量抽提、酶切鉴定;第二部分:电子节能控温仪设定温度80℃,接触时间12秒在SD大鼠背部制作深Ⅱ°烧伤创面模型（病理证实）;以编码绿色荧光蛋白的pEGFP为报告基因质粒,优化基因枪使用参数（氦气压力）。第三部分:SD大鼠深Ⅱ°烧伤创面基因枪转染pCI-neo-bFGF,以转染空载体pCI-neo为阴性对照。通过肉眼观察创面完全上皮化记录创面愈合时间,Elisa试剂盒测定创面组织羟脯氨酸含量和胶原酶-1含量,进行创面愈合指标评价。四、实验结果:第一部分:对之前所构建的pCI-neo-bFGF进行大量抽提,得到1μg/μl满足实验量的pCI-neo-bFGF。酶切鉴定显示条带与bFGF基因片段及pCI-neo质粒大小相对应。第二部分:病理切片显示在SD大鼠背部成功制作出深Ⅱ°烧伤创面。以350 psi（1psi=6890Pa）氦气压力,可将携有基因的金微粒导入SD大鼠深Ⅱ°烧伤创面。第三部分:基因枪转人bFGF基因与对照相比较可缩短深Ⅱ°烧伤创面愈合时间,增加创面愈合期间组织羟脯氨酸和胶原酶-1含量。五、结论:本实验抽提出1μg/μl前期构建成功的pCI-neo-bFGF。其后使用电子节能控温仪成功构建了SD大鼠深Ⅱ°烧伤创面模型,并得到了适用于深Ⅱ°烧伤创面的基因枪使用参数。利用优化后的参数,将人bFGF基因转染SD大鼠深Ⅱ°烧伤创面,证实此项技术可加快创面愈合进程,表现在缩短创面愈合时间,增加创面愈合期间组织羟脯氨酸和胶原酶-1含量。证明基因枪转人bFGF基因用于治疗深Ⅱ°烧伤创面是有效可行的。
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