商陆抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究

论文摘要

第一部分天然PAP-S的制备及其毒性研究目的：从美洲商陆种子中提取天然PAP-S,研究其对小鼠的急性及亚急性毒性。方法：采集美洲商陆种子,粉碎后加蒸馏水搅拌离心。上清液通过酸碱柱CM-Sephadex C-50分离酸性及碱性蛋白,碱性蛋白通过分子筛Sehpadex G-50柱收集第一洗脱峰,浓缩后通过酸碱柱CM-Sephadex C-52再次分离酸碱性蛋白,收集第二洗脱峰。SDS-PAGE检测分子量,BCA法测定蛋白质浓度。将80只昆明小鼠随机分为8组,单次腹腔注射PAP-S,每组浓度分别为0.5、0.7、1、1.4、2、2.8、4、5.6mg/kg,观察注射后14天内小鼠的健康状况及死亡率。40只昆明小鼠随机分为4组,连续14天腹腔注射PAP-S,浓度分别为0、0.125、0.25、0.5mg/kg,停药一天后采血检测血清ALT、BUN水平,取肝、肾组织做HE染色。结果：洗脱后得到分子量约为30KD的单一条带,冻干后得到约200mg粉末。取1mg粉末溶于1ml生理盐水,BCA测得蛋白浓度为0.6mg/ml。小鼠的急性毒性实验显示3天和14天时LD50分别为2.41和1.75mg/kg。亚急性毒性试验显示,高浓度PAP-S组血清ALT水平较阴性对照组轻度升高,但各组间BUN水平无显著性差异。HE染色未见明显病理变化。结论：成功制备了天然PAP-S。低浓度PAP-S无明显肝肾毒性。第二部分天然PAP-S体内抑制HBV复制的研究目的：探讨天然PAP-S在HBV转基因小鼠模型体内抗HBV的效果。方法：给药前,将24只HBV转基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg水平配对,分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP-S 0.125mg/kg及0.25mg/kg组。持续给药45天,于给药第15、30、45天及停药15天后白眼眶静脉丛采血,荧光定量PCR法检测小鼠血清中HBV DNA含量,ELISA法检测血清HBsAg水平；取肝、肾组织,行HE染色观察给药后小鼠肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏HBsAg阳性细胞的数量,real time RT-PCR测肝组织中HBV复制中间体mRNA含量。结果：与生理盐水组相比,45天时拉米夫定组、PAP-S 0.125mg/kg、0.25mg/kg组对血清HBV DNA的抑制率分别为75.7%（P<0.01）、68.9%（P<0.01）、78.7%（P<0.01）；对HBsAg的抑制率分别为29.7%（P<0.01）、23.3%（P<0.01）、36%（P<0.01）。各组肝肾组织HE染色均未见明显病理变化。免疫组化染色显示PAP-S组小鼠肝脏组织中HBsAg阳性细胞数量较生理盐水组减少。RT-PCR结果显示天然PAP-S组HBV mRNA水平被抑制。结论：0.125及0.25mg/kg天然PAP-S在慢性乙肝病毒感染小鼠模型中对HBVDNA、HBsAg、HBV mRNA有抑制作用。第三部分全长及不同片段缺失型PAP基因及与HBV核心蛋白融合原核表达质粒的构建及蛋白纯化目的：构建全长及不同片段缺失型PAP基因原核表达质粒及与HBV核心蛋白融合的PAP原核表达质粒,并进行蛋白纯化。方法：以PGEM-PAP质粒为模板设计引物,PCR扩增得到全长及不同片段缺失型PAP基因,经酶切、连接后测序确认。以已测序的全长及不同片段缺失型PAP质粒及HBc质粒为模板设计引物,PCR扩增PAP-HBc融合基因,与PMD-18T载体连接并转化,经酶切鉴定及DNA序列检测均证实为目标序列。将原核载体pET-28a与构建好的克隆用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,连接酶切产物,经测序证实得到pET-28a-PAP-HBc原核质粒。将全长PAP、全长PAP-HBc融合质粒转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylthio-B-D-Galactoside,IPTG）诱导后经镍离子亲和层析柱分离纯化,得到目的蛋白。结果：构建的全长及不同片段缺失型PAP基因的原核表达质粒、PAP-HBc融合基因原核表达质粒经双酶切及测序,证实各基因正确地插入到载体中,且读码框正确。诱导分离纯化得到的蛋白,经SDS-PAGE检测证实为目的蛋白。结论：成功地构建了全长和不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒。并纯化出部分已构建质粒的蛋白。第四部分全长及HBc融合PAP基因原核表达蛋白体内抗HBV的研究目的：观察PAP12及PAP12-HBc融合蛋白在慢性乙肝病毒感染的小鼠体内对HBV的抑制作用。方法：给药前,将24只HBV转基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg水平配对,分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP12组（0.125mg/kg）及PAP12-HBc融合蛋白组（0.125mg/kg）.持续给药45天,于给药第15、30、45天及停药15天后自眼眶静脉丛采血,荧光定量PCR法检测小鼠血清中HBV DNA含量,ELISA法检测血清HBsAg水平；取小鼠肝、肾组织,行HE染色观察给药后肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏HBsAg阳性细胞的数量,real time RT-PCR测肝组织中HBV复制中间体mRNA水平。结果：与生理盐水组相比,45天时PAP12组、PAP12-HBc融合蛋白组对血清HBVDNA的抑制率分别为73%（P<0.01）、77%（P<0.01）；对HBsAg的抑制率分别为24.7%（P<0.01）、27.2%（P<0.01）。各组HE染色均未见肝肾组织有明显病理变化。免疫组化染色显示PAP12组及PAP12-HBc融合蛋白组小鼠肝脏中HBsAg阳性细胞数量较生理盐水组减少。PAP12组、PAP12-HBc融合蛋白组的HBV mRNA较生理盐水组少。结论：PAP12及PAP12-HBc融合蛋白在慢性HBV感染小鼠体内对HBV有抑制作用,并未见明显肝肾毒性。

论文目录

• 英文缩写词及中文对照
• 前言
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 技术路线
• 第一部分 天然PAP-S的制备及毒性研究
• 一 引言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 第二部分 天然PAP-S体内抑制HBV复制的研究
• 一 前言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 第三部分 全长及不同片段缺失型PAP基因及与HBV核心蛋白融合原核表达质粒的构建及蛋白纯化
• 一 前言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 第四部分 全长及与HBV核心蛋白融合PAP原核表达蛋白体内抗HBV的研究
• 一 前言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 总结和展望
• 综述
• 参考文献
• 致谢