论文摘要
研究背景恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病,也是当今社会蔓延最快的疾病之一,全世界每年约有1000多万新增病例。根据2008年WHO统计,因肿瘤致死人数占世界总死亡人数的13%。在美国、新加坡等国家,肿瘤致死人数占到了总死亡人数的1/4-1/3,仅次于心脏病致死率。虽然近5年来,肿瘤生存率与过去几十年相比有了明显提高,但肿瘤相关死亡率没有显著的变化,生存率的提高归功于肿瘤的早期发现及治疗手段的提高。在西方国家,急性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液肿瘤均位于恶性肿瘤发病的前十位,在我国发病率也呈逐年升高的趋势。我国每年新增淋巴瘤患者约2.5万人,其中非霍奇金淋巴瘤的发病人数年递增率达到3%-5%,是所有恶性肿瘤中增长速度最快的。目前,恶性血液肿瘤的治疗主要有化疗、放疗、诱导分化治疗以及造血干细胞移植等方法。化疗是一种有效而经典的肿瘤治疗手段,但化疗药物通常在杀死肿瘤细胞的同时也杀死正常细胞如小肠内皮细胞和骨髓细胞,从而产生严重的不良反应和并发症,不但限制了化疗药物足量应用而达到最佳疗效,还直接导致原发肿瘤不能被控制,最终导致治疗效果不理想。因此,针对恶性血液肿瘤的靶向药物治疗已成为近年来的研究热点。纳米技术的发展使得纳米靶向药物在肿瘤治疗领域显示出巨大的应用潜能。纳米医学是一门新型学科,该学科是随着纳米生物医药发展起来的用一系列纳米技术解决医学问题的学科。纳米技术的发展将给生物医学领域产生深刻的影响,主要体现在诊断和治疗肿瘤方面。纳米药物因其科学价值和潜在应用前景日益受到关注。多柔比星是临床上常用治疗恶性血液肿瘤的蒽环类化疗药物之一,其对血液肿瘤的治疗效果显著。但由于多柔比星在实际应用中的副作用,如心脏毒性、肝脏毒性、骨髓抑制等,导致多柔比星在临床上的应用受到一定限制。为了达到较好的疗效而最大限度减少多柔比星的毒副作用,开发具有高吸附能力和快速吸附的新药物载体引起国内外同行的密切关注。氧化石墨烯（graphene oxide, GO）是碳家族的一种新型二维纳米材料,有学者在2004年成功制备出氧化石墨烯,由于成功制备了氧化石墨烯而在2010年获得诺贝尔奖。氧化石墨烯在很多方面的应用研究取得了很好的成果,但在药物载体方面潜在价值的研究还处在初级阶段,在药物载体方面的研究得到了本课题的密切关注。目的和方法本课题首先成功制备了纳米新碳材料-氧化石墨烯,应用相应仪器和技术对氧化石墨烯进行了一系列的表征,然后以斑马鱼为动物模型研究了氧化石墨烯的胚胎发育毒性。第二,研究了氧化石墨烯负载抗血液肿瘤药物（多柔比星）的载药量和氧化石墨烯负载多柔比星的影响因素,为制备抗血液肿瘤纳米药物提供理论基础。第三,利用细胞培养和细胞毒试验研究了氧化石墨烯负载多柔比星后对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用,为血液肿瘤靶向纳米药物的开发提供理论依据。研究结果1.通过Hummers方法制备了氧化石墨烯,利用透射电子显微镜（TEM）、傅里叶红外光谱仪、Zeta电位仪、元素分析等仪器或方法对氧化石墨烯的理化性进行了表征。氧化石墨烯（GO）的形态结构通过透射电子显微镜（TEM）进行表征,结果显示氧化石墨烯是单层纳米材料。元素分析显示氧化石墨烯的元素组成有碳（C）、氮（N）、氢（H）和氧（0）,这些元素在氧化石墨烯中所占比例分别为碳（C）,45.17%；氮（N）,0.78%；氢（H）,3.15%：氧（0）,50.90%。用傅里叶红外光谱对氧化石墨烯所含的官能团进行分析,结果显示氧化石墨烯含有羟基（-OH）官能团、羰基（C=0）官能团和C-0官能团,这些官能团都是含氧官能团。Zeta电位仪检测zeta电位显示pH值在3.4～8.5之间,氧化石墨烯都是负电位,即氧化石墨烯所带的电荷为负电荷。2.以斑马鱼为动物模型,利用斑马鱼胚胎研究了氧化石墨烯的胚胎发育毒性,研究结果如下：在氧化石墨烯浓度为100mg/L的情况下,斑马鱼胚胎的孵化率达0.9446±0.01604,与正常对照组比较,p=0.079,差异没有统计学意义：在氧化石墨烯浓度为100mg/L的情况下,斑马鱼胚胎畸形率为0.2191±0.13236,与正常对照组比较,p=0.087,差异无统计学意义；在氧化石墨烯浓度为100mg/L的情况下,斑马鱼胚胎死亡率达0.2426±0.15717,与正常对照组比较,p=0.068,差异无统计学意义：在氧化石墨烯浓度为100mg/L的情况下,在60hpf时,斑马鱼心跳为35.1840±3.91240/15s,与正常对照组比较,p=0.342,差异无统计学意义；在氧化石墨烯浓度为100mg/L的情况下,在72hpf时,斑马鱼幼鱼体长为3.3835±0.18943,与正常对照组比较,p=0.374,差异无统计学意义。3.研究了氧化石墨烯作为抗血液肿瘤药物载体的可行性。研究氧化石墨烯吸附多柔比星的过程,以及在此过程中,氧化石墨烯与多柔比星的接触时间、氧化石墨烯用量、反应温度和pH等参数对氧化石墨烯（GO）吸附多柔比星（DOX）的影响。结果显示在室温时（288K）,氧化石墨烯吸附多柔比星的最大吸附值为1428.57mg/g,氧化石墨烯吸附多柔比星的吸附等温线数据符合Langmuir模型,吸附的动力学符合准二级动力学模型。对氧化石墨烯吸附多柔比星的热力学的研究表明氧化石墨烯吸附多柔比星是自发的、吸热的,即在加热的情况下有利于氧化石墨烯吸附多柔比星。同时,氧化石墨烯与药物之间的作用力与溶液的酸碱度相关。氧化石墨烯对多柔比星的高效负载是依靠氧化石墨烯巨大的比表面积以及与多柔比星之间的π-π堆积作用。4.以氧化石墨烯、多柔比星、氧化石墨烯装载多柔比星为研究对象,运用细胞培养技术和细胞毒检测技术,研究了氧化石墨烯、多柔比星、氧化石墨烯装载多柔比星对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的杀伤作用。4.1cck-8法检测纳米氧化石墨烯、多柔比星、氧化石墨烯装载多柔比星对RPMI8226细胞增殖的影响。氧化石墨烯（浓度为0,10,25,50,100mg/L）时对多发性骨髓瘤细胞的作用与正常对照组比较,细胞存活率（p均<0.05）,差异有统计学意义,表明氧化石墨烯在0-100mg/L浓度下对多发性骨髓瘤细胞有低毒性。在氧化石墨烯浓度为50mg/L,多柔比星浓度为2m/L时,氧化石墨烯负载多柔比星（GO50mg/L+DOX2mg/L）时CCK-8检测结果如下：氧化石墨烯组细胞存活率为（84.6±0.4）%,多柔比星组细胞存活率为（71.7±1.0）%,氧化石墨烯装载多柔比星细胞存活率为（62.6+7.3）%。结果显示,氧化石墨烯装载多柔比星组与多柔比星组比较,1p=0.027,差异有统计学意义,但去除氧化石墨烯的影响比较,p>0.05,说明氧化石墨烯不降低多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性。4.2流式细胞仪测定氧化石墨烯、多柔比星、氧化石墨烯装载多柔比星对RPMI8226细胞的细胞周期的变化。在多柔比星浓度为2m/L,氧化石墨烯浓度为50mg/L,氧化石墨烯负载多柔比星（GO50mg/L+DOX2mg/L）时,细胞周期检测结果显示,GO/Gl、S、G2/M期,实验组与正常对照组相比,P均>0.05,差异均无统计学意义。结果表明氧化石墨烯不影响多发性骨髓瘤细胞的细胞周期。4.3氧化石墨烯对多发性骨髓瘤细胞的凋亡检测结果显示正常对照（0mg/L）组与GO组（浓度为10,50,100mg/L）比较,p均>0.05,差异均无显著性。表明GO浓度在0-100m/L时不诱导细胞凋亡。在多柔比星浓度为2mg/L,氧化石墨烯浓度为50mg/L时,氧化石墨烯负载多柔比星（GO50mg/L+DOX2mg/L）时,细胞凋亡检测结果显示多柔比星组、氧化石墨烯负载多柔比星组与正常对照组比较,P<0.05,差异有统计学意义。氧化石墨烯负载多柔比星组与多柔比星组比较（P>0.05）,无统计学差异。结果显示多柔比星可以诱导细胞凋亡,氧化石墨烯不降低多柔比星诱导细胞凋亡的能力。研究结论1、本课题成功制备了氧化石墨烯,并以斑马鱼为动物模型研究发现氧化石墨烯没有明显的胚胎发育毒性；2、研究氧化石墨烯作为药物载体时,发现氧化石墨烯具有很强的载药能力,研究影响氧化石墨烯对抗血液肿瘤药物（多柔比星）的载药能力的因素时,发现温度的变化、pH值的改变、氧化石墨烯的加入量能影响氧化石墨烯对抗血液肿瘤药物（多柔比星）的载药能力；3、氧化石墨烯负载抗血液肿瘤药物（多柔比星）后对多发性骨髓瘤的杀伤能力的研究发现,氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞有显著抑制增殖的作用,但氧化石墨烯不降低多柔比星对细胞的抑制作用。其抑制作用不是通过阻滞血液肿瘤细胞的细胞周期实现的,氧化石墨烯低浓度时不诱导细胞凋亡,不降低多柔比星诱导细胞凋亡的能力。可适合做抗血液肿瘤纳米药物的载体。