黄龙病菌侵染过程中柑橘防御相关基因的克隆及表达分析

论文摘要

柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB ）是由柑橘黄龙病菌（Ca. Liberibacter）引起的柑橘毁灭性病害,由于对黄龙病菌以及柑橘与黄龙病菌侵染过程中相互作用机理仍不清楚,柑橘黄龙病的抗病育种方面至今仍然没有大的突破。研究柑橘宿主对黄龙病菌的应答机制,能够帮助我们阐明其发病机理病开发有效地管理措施。本研究目的是根据前期构建的柑橘健株与感染黄龙病的病株差减（SSH）文库,筛选到了差异表达的CsMYB（MYB转录因子）、CsCAD（肉桂醇脱氢酶）基因病得到了它们的EST序列,通过克隆和分析这些基因的功能,并运用实时定量PCR技术跟踪研究它们的表达情况,研究它们对黄龙病菌侵染的作用,探索柑橘黄龙病菌侵染机理及柑橘感染黄龙病菌后的防御机理。为柑橘抗黄龙病的分子生物学研究提供基础,为柑橘黄龙病防治与柑橘抗性育种提供理论依据与技术支撑,从而使得柑橘黄龙病的防治得到进一步的发展。本研究方法主要是根据所到的CsMYB、CsCAD的EST序列设计引物,从甜橙（Citrus sinensis）叶片中提取RNA利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）分别克隆CsMYB、CsCAD基因的cDNA全长,同时利用生物信息学的方法预测分析两基因的特征及功能;利用实时荧光定量PCR分析两基因在黄龙病菌的胁迫下表达特点。本研究主要研究结果及结论如下:1.获得了CsMYB（GenBank登录号为HQ841074）基因的cDNA全长,进行生物信息学分析。CsMYB基因的cDNA全长为1306bp,生物信息学分析显示,该基因包括一个909bp的完整开放读码框以及一个典型的26bp poly-A,编码302个氨基酸,分子量为32.97kD,等电点为8.5,同时,还有MYB类基因的保守特征区域,即在N端有两个典型的MYB DNA结合域:R2和R3;2.得到了CsCAD（GenBank登录号为HQ841075）的cDNA全长,全长为1124bp。信息学分析显示,该基因包括一个897bp的完整开放读码框,编码298个氨基酸,分子量为32.45kD,等电点为6.4,同时还有两个保守区域:ADHN和ADHzincN。3.利用定量PCR分析了CsMYB和CsCAD在黄龙病菌侵染的不同时期的表达情况。定量分析显示CsMYB基因在侵染的不同时期,CsMYB基因的表达呈现“低-高-低”的趋势。相比对照,在接种后大约一个月左右,CsMYB基因表达量较低,有微弱的上升趋势;一个月以后,伴随着病菌的增殖,基因的表达量上升到一个较高的水平,为对照的2-3倍,3个月以后柑橘黄龙病病症显现;以后,随着病症的加重,CsMYB基因的表达量开始下降甚至比对照还要低的水平,并维持在一个低的水平。CsCAD基因的表达也基本呈现“低-高-低”的趋势,但相比对照增长的幅度更大。在接种后20天左右,CsCAD表达基本没变化,但在一个月以后表达量迅速上升,最高为对照的10倍以上,3个月以后表达量开始下降,并最终维持在一个较低的水平上,但仍高于对照。4.根据克隆到的CsMYB、CsCAD的cDNA序列,分析它们的序列特征及功能,同时根据定量分析得到的结果,推测CsMYB是一个转录因子基因,CsCAD是肉桂醇脱氢酶基因,它们可能参与柑橘对黄龙病菌的防御反应过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 柑橘黄龙病简介
• 1.1.1 柑橘黄龙病的发生与危害
• 1.1.2 柑橘黄龙病菌的菌系与分类研究
• 1.1.3 柑橘黄龙病检测与防治
• 1.2 植物的防御反应
• 1.3 MYB 转录因子和CAD（肉桂醇脱氢酶）简介
• 1.3.1 MYB 转录因子的研究进展
• 1.3.2 CAD （肉桂醇脱氢酶） 的研究进展
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 研究内容和技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 1.6 创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 主要试剂
• 2.4 主要仪器
• 2.5 主要溶液配制
• 2.6 实验方法
• 2.6.1 柑橘总RNA 的提取
• 2.6.2 RACE 方法克隆CsMYB 和CsCAD 全长cDNA 序列
• 2.6.3 PCR 产物与载体连接及测序
• 2.6.4 CsMYB 和CsCAD 基因的生物信息学分析
• 2.6.5 实时荧光定量检测CsMYB 和CsCAD 基因的表达
• 3 结果与分析
• 3.1 CsMYB 基因的克隆与分析
• 3.1.1 CsMYB 基因cDNA 的克隆
• 3.1.2 CsMYB 基因cDNA 的生物信息学分析
• 3.1.3 CsMYB 基因荧光定量PCR 分析
• 3.2 CsCAD 基因的克隆与分析
• 3.2.1 CsCAD 基因cDNA 的克隆
• 3.2.2 CsCAD 基因cDNA 的生物信息学分析
• 3.2.3 CsCAD 基因荧光定量PCR 分析
• 4 讨论
• 4.1 CsMYB 的功能和表达分析
• 4.2 CsCAD 的功能和表达分析
• 5 结论及后续工作建议
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A.CsMYB 与CsCAD 基因序列与柑橘基因组比对结果
• B.攻读硕士学位期间发表的论文