转化植物甾醇为雄甾烯酮菌株的筛选鉴定及发酵工艺的研究

论文摘要

雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-烯-3,17-二酮（ADD）可以作为几乎所有甾体激素类药物不可替代的中间体,对机体起着非常重要的调节作用。本文研究的核心是分离、筛选一株性能良好的菌株,能够转化植物甾醇（Plant sterol）生产AD与ADD,确立适宜的分析测定方法,确定最佳发酵条件、合适的工艺参数、最优培养基、摸索底物的投加方式,从而为将来的工业化生产做一些基础性工作。主要研究内容包括以下几个方面:确立了分析测定植物甾醇侧链降解过程中底物植物甾醇和产物AD及ADD的方法。采用薄板层析的方法成功的分离了底物与产物,从而能快速简便的监测底物的消耗与产物的生成情况。根据产物AD与ADD在紫外区的吸收情况,利用254nm与298nm双波长测定AD与ADD的生成量。采取比色法对底物植物甾醇进行了定量测定,高效液相色谱法能对产物精确的测定,液质联用法可以对产物分子量进行了确定。所确立的分析方法对植物甾醇微生物转化的分析与工厂进行监测提供了较好的指导。从分离的200多株菌中筛选出将一株高效转化植物甾醇为AD与ADD的菌株ST06-95。对该菌进行了形态、生理生化的研究,并用16S rDNA的方法对其进行鉴定。结果发现菌株ST06-95可以利用多种碳源,不利用纤维素,可以水解淀粉。将该菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列对比,发现其序列与Bacillus属Bacillus Amyloiquefaciens的16 S rDNA序列相似性最高,达到99.9%,初步将该菌命名为Bacillus Amyloiquefaciens ST06-95。以菌株Bacillus sp ST06-95为出发菌株对植物甾醇进行选择性侧链降解制备AD和ADD。对转化条件如底物浓度、投料方法、投料时间进行了摸索,对发酵初始pH、转化时间、发酵温度、接种量、培养基组成等进行了优化。结果表明用0.4%的Tween 80配合超声波溶解、底物浓度为0.5%、菌体未生长时投加底物转化效果最佳。最佳发酵条件为:初始pH 7.0、接种量12%、发酵温度30℃、发酵时间168h,发酵培养基中甘油与葡萄糖的含量为1:4。在最佳转化条件下产物ADD与AD的得率从优化前的29.5%提高到42.5%,其中ADD与AD的含量比值大约10:1。在摇瓶实验的基础上,进行了5L罐扩大培养实验,在培养过程中保持转化温度为30℃,通过调节空气流量与搅拌转速保持充足的供氧,5L罐转化时间减少为144h。结果显示投料量为0.5%,底物转化率为99%, ADD与AD总得率为45%以上;投料量为0.8%,底物转化率为95%左右,ADD与AD总得率为40%左右;投料量为1.0%,底物转化率为50%-60%,产物生成率达到30%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 甾体化合物的结构、分类与应用
• 1.2 甾体药物的发展
• 1.2.1 甾体药物的研究发展史
• 1.2.2 甾体药物的化学合成
• 1.2.3 甾体药物微生物转化
• 1.3 微生物甾体侧链降解
• 1.3.1 微生物对甾体侧链降解的途径
• 1.3.2 微生物对甾体母核的降解途径
• 1.3.3 控制微生物选择性降解甾体侧链
• 1.4 甾体边链降解微生物转化反应共性难题
• 1.4.1 底物的溶解性
• 1.4.2 投料方式的选择
• 1.4.3 细胞壁膜的阻碍作用
• 1.5 本课题的立题依据
• 1.5.1 雄甾烯酮ADD 与AD 的作用和意义
• 1.5.2 国内外甾体药物工业的现状
• 1.5.3 国内外技术水平分析
• 1.5.4 国内外市场现状和发展趋势
• 1.5.5 丰富的植物甾醇的来源植物
• 1.6 本论文的研究内容
• 第二章 微生物转化植物甾醇为ADD 与AD 分析测定方法的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 BS、ADD、AD 的定性分析—薄层层析法（TLC）
• 2.2.4 BS 的定量分析—可见分光光光度法（VS）
• 2.2.5 ADD 与AD 的定量
• 2.2.6 ADD 与AD 的鉴定—液质联用法（HPLC-MS）
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 薄层层析法对BS、ADD、AD 的定性检测
• 2.3.2 可见分光光光度法定量BS
• 2.3.3 紫外吸收光谱法定量 ADD、AD
• 2.3.4 高效液相色谱法定量ADD、AD
• 2.3.5 ADD、AD 的液质联用图谱
• 2.3.6 转化效果的评价方法
• 2.4 本章主要结论
• 第三章 转化植物甾醇为ADD、AD 菌株的筛选与鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 目的菌株的筛选
• 3.2.5 发酵样品的分析
• 3.2.6 目的菌株的鉴定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌株筛选结果
• 3.3.2 菌株ST06-95 转化产物的HPLC 验证
• 3.3.3 HPLC-MS 鉴定菌株ST06-95 转化植物甾醇的产物
• 3.3.4 菌株ST06-95 形态特征与培养特征
• 3.3.5 菌株ST06-95 生理生化特征
• 3.3.6 菌株ST06-95 的遗传学特征
• 3.4 本章主要结论
• 第四章 菌株 Bacillus sp ST06-95 转化植物甾醇为 ADD、AD 发酵条件的优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株与试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 种子培养
• 4.2.5 摇瓶发酵
• 4.2.6 发酵样品的处理与分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 转化条件的优化
• 4.3.2 投料溶解与添加方式对转化的影响
• 4.3.3 正交设计法优化发酵培养基确定最佳发酵培养基
• 4.4 本章主要结论
• 第五章 菌株 Bacillus sp ST06-95 转化植物甾醇为 ADD、AD 的工艺放大研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株与试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 培养基
• 5.2.4 培养方法
• 5.2.5 发酵样品的处理与分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 转化时间的确定
• 5.3.2 通气量与搅拌速率的确定
• 5.3.5 卵磷脂添加量对转化情况的影响
• 5.3.4 不同底物浓度下的对转化情况
• 5.3.5 细胞固定化法对产物生成的影响
• 5.3.6 全细胞转化对产物生成的影响
• 5.3.7 底物流加对产物生成的影响
• 5.4 本章结论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢