牙鲆胚胎的玻璃化冷冻保存的研究

论文摘要

本以文牙鲆胚胎为材料,研究了麦管直径、平衡温度、装卵个数等影响鱼类胚胎玻璃化冷冻保存的几个方面的内容。对牙鲆胚胎的玻璃化冷冻保存方法和条件进行了优化,特别对玻璃化液组成进行了改良,对胚胎发育时期和平衡时间进行了筛选,对胚胎的冷敏感性和冷冻损伤机理进行了探讨。 结果表明:含有多种抗冻剂的玻璃化液PMDD（2%PVP）,玻璃化稳定,脱玻璃化率较低,适宜进行玻璃化冷冻。在胚胎发育过程中,牙鲆各期胚胎对玻璃化液的适应能力不同,尾芽期胚胎较其他时期耐受力强。冻前平衡时间跟牙鲆胚胎的质量有密切的关系,一般情况下,在玻璃化液PMDD（2%PVP）中平衡40min就足以使玻璃化液渗透完全;时间延长,成活率显著降低（P<0.05）。牙鲆胚胎在0℃与4℃下平衡的成活率显著高于15℃（P<0.05）。非渗透性抗冻剂PVP、Ficoll可以增强玻璃化液的稳定性,降低脱玻璃化率。牙鲆胚胎具有高的冷敏感性,温度降到0℃以下,成活率显著降低;这种冷敏感性随胚胎发育阶段而变化,发育后期的胚胎比发育早期的胚胎显示出了对低温更高的耐受力。在三种规格的麦管中,直径为2.5mm的麦管脱玻璃化率最低,适宜进行玻璃化冷冻保存的研究;在1个直径2.5mm的麦管中装入2-5粒牙鲆胚胎,脱玻璃化率的改变无显著差异。牙鲆胚胎的冻前平衡过程及洗脱过程的显微观察表明,抗冻剂向胚胎渗透的最大障碍是卵黄囊;牙鲆胚胎在进行玻璃化冷冻保存时,卵黄囊是极易受损伤的部位。 根据优化的条件,对牙鲆两个时期的胚胎进行超低温冷冻保存实验,共成活4次,获得成活胚胎8粒,其中7粒孵化出健康的鱼苗。本文为鱼类胚胎冷冻保存技术的建立提供基础资料,并证明了牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存的可能性。

论文目录

• 摘要
• 1 玻璃化冷冻保存研究的进展及意义
• 1.1 生物体超低温冷冻保存的基本原理
• 1.2 鱼类胚胎冷冻保存的意义
• 1.3 鱼类胚胎冷冻研究进展
• 1.4 影响鱼类胚胎冷冻的主要因子
• 1.4.1 胚胎发育阶段的影响
• 1.4.2 冻前处理及抗冻剂种类和浓度
• 1.4.3 卵膜的通透性
• 1.4.4 解冻及冻后处理
• 1.5 鱼类胚胎玻璃化冷冻保存的研究方向
• 1.5.1 鱼类胚胎低温生物学基础研究
• 1.5.2 脱玻璃化现象的研究
• 1.5.3 寻找新的合适的低温保护剂
• 1.5.4 核磁共振显微术在冷冻保存中的应用
• 2 抗冻保护剂的毒性试验
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 抗冻保护剂
• 2.2.2 牙鲆胚胎的收集与培养
• 2.2.3 单种抗冻保护剂的毒性试验
• 2.2.4 两种抗冻保护剂的毒性中和作用试验
• 2.2.5 两种抗冻剂联合使用的毒性试验
• 2.2.6 数据处理
• 2.3 结果
• 2.3.1 单种抗冻保护剂的毒性试验
• 2.3.1.1 室温下单种抗冻保护剂的毒性
• 2.3.1.2 0℃下单种抗冻保护剂的毒性
• 2.3.2 两种抗冻保护剂的毒性试验
• 2.4 讨论
• 3 玻璃化液及麦管规格的筛选
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 麦管
• 3.2.2 含两种渗透性抗冻剂的玻璃化液的筛选试验
• 3.2.3 多种玻璃化液的筛选
• 3.2.4 非渗透性抗冻剂对玻璃化液的影响
• 3.2.5 麦管规格的筛选
• 3.2.6 统计方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 含两种渗透性抗冻剂的玻璃化液的筛选试验
• 3.3.1.1 两种渗透性抗冻剂的玻璃化液的初步筛选
• 3.3.1.2 PG与Met适宜比例的筛选
• 3.3.1.3 含多种抗冻剂的玻璃化液的筛选
• 3.3.2 非渗透性抗冻剂对玻璃化液的影响
• 3.3.3 麦管规格的筛选
• 3.4 讨论
• 4 胚胎时期和平衡时间的筛选
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 牙鲆胚胎的采集和培养
• 4.2.2 胚胎时期的筛选
• 4.2.3 平衡时间的筛选
• 4.2.4 统计方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 平衡时间的筛选实验
• 4.3.2 胚胎时期的筛选
• 4.4 讨论
• 5 牙鲆胚胎对冷的敏感性和装卵个数对玻璃化液的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 牙鲆胚胎的采集和培养
• 5.2.2 牙鲆胚胎对冷的敏感性试验
• 5.2.3 装卵个数对玻璃化液的影响
• 5.3 结果
• 5.3.1 牙鲆胚胎对冷的敏感性试验结果
• 5.3.2 装卵个数对玻璃化冷冻的影响
• 5.4 讨论
• 6 牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存及冷冻损伤机理的分析
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 牙鲆胚胎的采集与培养
• 6.2.2 牙鲆胚胎冷冻保存前的平衡过程及洗脱过程的显微观察
• 6.2.3 牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存试验
• 6.2.4 牙鲆胚胎冷冻损伤机理的分析
• 6.2.5 数据处理
• 6.3 结果
• 6.3.1 牙鲆胚胎冷冻保存前的平衡过程及洗脱过程的显微观察
• 6.3.2 牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存试验
• 6.3.3 牙鲆胚胎冷冻损伤机理的分析
• 6.4 讨论
• 参考文献
• 致谢