在体肥厚心肌细胞实现钙调神经磷酸酶Aβ基因沉默的研究

论文摘要

背景与目的心肌肥大被公认为是心血管疾病发病和死亡的独立危险因素，钙调神经磷酸酶（CaN）已被证明在心肌肥大过程中扮演重要角色。目前最常用的CaN抑制剂环孢素A（CsA）及FK506虽可通过干扰CaN通路抑制心肌肥大的发生发展，但二者的免疫抑制等副作用不适于临床广泛应用，因而探索安全有效的CaN通路干预手段对心肌肥大的防治具有十分重要的意义。本研究采用RNA干扰（RNAi）技术，首先在细胞水平上筛选针对CaN AβmRNA的有效干扰序列；然后在整体动物水平探索有效心肌组织转染途径；最后进行肾性高血压肥厚心肌组织转染抑制CaNAβ基因表达。旨在为改善非病毒载体的转染效率、获得相对广泛的在体心肌细胞转染提供具有一定可行性的新思路；在整体动物水平上抑制心肌CaNAβ基因表达，为心肌肥大防治探索一种安全、有效的新途径。方法（一）有效靶序列的筛选：针对CaNAβ基因的3个RNAi位点构建小发夹RNA（shRNA）表达载体（si1280，si1539，si1053），转染乳鼠心肌细胞。实验分组：空白对照组，不加入任何处理因素；醛固酮（Ald）组：每孔加入Aid 10-9mol／L；si1280转染组，si1539转染组，si1053转染组，阴性对照（siGFP转染）组（每孔除加入Ald外，分别转染不同的shRNA表达质粒）。转染48h后检测心肌细胞直径、CaN Aβ及肥大相关基因ANF、β-MHC的mRNA水平。（二）整体动物水平上探讨心肌有效转染途径：以PLacZ为报告基因，将成年大鼠分为空白对照纽（生理盐水心包腔内注射后超声导入）；转染质粒心包腔内注射组及其阴性对照组：质粒（阴性对照组用生理盐水）+微泡+酶的混合物心包腔内注射，超声导入；转染质粒舌下静脉注射组及其阴性对照组：质粒（阴性对照组用生理盐水）+微泡混合液经舌下静脉注射，超声导入。转染6天后处死，进行心、肝、肾、肺组织X-gal染色，观察心肌细胞转染情况及心外组织目的基因的表达。（三）在体心肌诱导CaN Aβ基因沉默，成年大鼠随机分为空白对照组；“一肾一夹”高血压心肌肥大模型组；心包腔内途径CaN Aβ干扰组及其阴性对照组；舌下静脉途径CaN Aβ干扰组及其阴性对照组。转染6天后处死，测定血浆心肌酶（CK，CK-MB，LDH）、转氨酶（GPT，GOT）及肾功能（Cr，UN，Ua）指标。取心肌组织检测CaN AβmRNA水平，CaNAβ免疫荧光观察蛋白表达。结果（一）Ald模型组与siGFP阴性对照组细胞直径及CaN Aβ、ANF、β-MHCmRNA水平较对照组明显增加（P＜0.05），Ald模型组及阴性对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。与阴性对照组比较，si1280、si1539、si1053转染组细胞直径及CaN Aβ、ANF mRNA水平降低（P＜0.05），si1280，si1053组β-MHCmRNA水平降低（P＜0.05）。三个干扰组之间CaN AβmRNA水平比较无差异（P＞0.05），si1280组细胞直径小于si1539及si1053组（P＜0.05），si1280 ANFmRNA水平较si1539、si1053明显降低（P＜0.05），si1280组β-MHC mRNA水平较si1539组降低（P＜0.05），与si1053组比较无明显差异（P＞0.05）。（二）在体心肌转染报告基因后，仅有心包腔内注射组大鼠心外膜下部分心肌细胞可见蓝染；各组大鼠肝、肾、肺组织x-gal染色阴性。（三）在体心肌CaN AβsiRNA表达质粒转染后，转染各组与心肌肥大模型组CaN AβmRNA水平比较无差异（P＞0.05），但免疫荧光结果显示心包腔内途径CaN Aβ干扰组较心肌肥大模型组心外膜下部分心肌荧光减弱。结论RNAi技术抑制CaN Aβ基因表达可有效减轻Ald诱导的心肌细胞肥大程度；CaN Aβ基因中si1280（21bp）片段为实现RNAi的更有效片段；微泡+酶类心包腔内注射超声导入的方法可有效改善非病毒载体在体心肌的转染效率，同时具有一定的靶向性，但总的转染范围仍然有限；采用这一方法进一步进行“一肾一夹”心肌肥大模型大鼠在体心肌细胞的CaNAβ的RNAi干预，发现心肌肥大大鼠心外膜下局部心肌细胞CaN Aβ蛋白水平降低，CaN AβmRNA水平虽有下降趋势，但无统计学差异，提示质粒的用量及超声导入的参数有待进一步研究使其优化。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 针对CaNAβ基因RNAi有效靶位的筛选
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 在体心肌细胞转染途径的比较
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 肾性高血压大鼠在体心肌CaNAβ干扰的实现及其效果
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢