论文摘要
研究背景铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）及鲍氏不动杆菌（Acinitobacter baumannii）为代表的非发酵细菌易引起医院内感染,近年来随着抗生素的更新换代及大量应用,免疫抑制剂及各种侵袭性诊断、治疗手段的应用,这两种菌引起的医院感染逐渐增多。而同时细菌的耐药问题日益严重,近年来更是出现了对除了多粘菌素外的所有抗假单胞菌及不动杆菌的抗生素包括青霉素类、头孢菌素类、单酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖甙类和碳青酶烯类等抗菌药物同时耐药的菌株,即泛耐药菌株（Pandrug-resistant strains）。除多粘菌素外目前所有市售的抗生素对其完全无效,患者一旦感染,往往使临床医师束手无策。而耐药铜绿假单胞菌及鲍氏不动杆菌耐药机制复杂,目前认为其耐药机制主要包括下列几种:⑴基因组上结构基因的突变、插入或缺失。⑵改变药物的作用靶点。⑶产生灭活酶:超广谱β-内酰胺酶、AmpCβ-内酰胺酶、金属β-内酰胺酶等。这些耐药机制共同参与了细菌耐药问题的形成。目前主要矛盾是有效新药上市率低而耐药菌株渐增,在新的有效药上市之前,人们研究方向主要有调整用药方案及研究现有其他类别药物的潜在抗菌活性。有报道不同的钙通道阻滞剂联用左氧氟沙星对耐药铜绿假单胞菌的效果各不相同,其中氨氯地平对耐药铜绿假单胞菌有效。也有报道称大环内酯类药物与其他药物联用使得临床铜绿假单胞菌感染的病人可提高临床治愈率。然而,对于这些药物的抗菌效果以及细菌耐药机制之间有什么联系,通过什么机制起作用则未见报道。因此有必要对此进行更深一步的研究,以便为治疗多药耐药非发酵菌的感染提供理论基础。目的通过研究大环内酯类以及钙通道阻滞剂氨氯地平对泛耐药菌株体外药敏试验中的干预作用及研究其与相关耐药机制的关联,并进一步建立肺炎模型,对其进行联合用药,观察疗效,以便为治疗泛耐株引起的感染提供理论基础。方法1.经VITEK-2微生物分析仪鉴定,按CLSI（2009版）标准,筛选出19株泛耐药铜绿假单胞菌和6株泛耐药鲍氏不动杆菌共25株泛耐药菌株,采用琼脂稀释法以及棋盘稀释法进行联合药敏试验,头孢他啶、阿米卡星和环丙沙星不同药物组合分别配成低浓度组（1MICs）和高浓度组（2MICs）,阿奇霉素浓度0.4mg/ml为低浓度组,3.9mg/ml为高浓度组。另一组不同组合的含药平皿加入氨氯地平进行干预,氨氯地平最终按说明书配成相当于常规用药后的血药浓度3.0ng/ml。2.采用E-TEST法对25株泛耐药株进行金属酶检测。采用Real-time PCR技术对25株泛耐株进行主动外排系统的检测,包括:MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN以及MexXY-OprM。3.选择体外药敏实验中各药物组合同时有效的一株铜绿假单胞菌建立小鼠肺炎模型,于感染后6小时给药,对照组腹腔注射0.5ml生理盐水,治疗组分别用头孢他啶+阿米卡星+环丙沙星以及头孢他啶+阿米卡星+环丙沙星+氨氯地平两组用药方案连续治疗三天后,根据肺组织匀浆细菌计数及病理结果评价疗效。结果1.头孢他啶分别与阿米卡星和环丙沙星联用,发生协同的比率环丙沙星组为36.8%、阿米卡星组为84.2%,琼脂稀释法中高浓度组合头孢他啶分别与阿米卡星、阿奇霉素、多西环素和环丙沙星联合,其有效率分别为0, 0,8%,12%;加入钙通道阻滞剂氨氯地平（3.0ng/ml）干预后,其有效率分别为0, 0,20%,28%（P=0.003）。而低浓度组两组差异无统计学意义。2.金属酶检测结果分离的19株泛耐药铜绿假单胞菌菌株中,金属酶阳性有8株,金属酶阴性的有11株;而6株泛耐药鲍氏不动杆菌菌株中,金属酶阳性的有2株,金属酶阴性的有4株,各药物组合中环丙沙星和多西环素组对部分金属酶阴性的菌株有效,而对金属酶阳性菌株来说,所有的药物组合都无效。3.对各联合用药组外排泵基因表达情况进行分析比较,所有因加入氨氯地平干预后有效的菌株,MexA均有高表达,部分有MexC、MexE和MexX的高表达,而对于加入氨氯地平干预后无效及金属酶阳性的菌株,各外排泵基因都有不同程度的高表达。4.体内药敏试验显示用药组不管有无氨氯地平干预,对细菌的清除作用与对照组比较差异有统计学意义（P﹤0.05）,而两用药组之间比较,差异无统计学意义。结论1.加入氨氯地平干预后,高浓度组合的多西环素组和环丙沙星组对部分金属酶阴性菌株有显著抑菌效果,以MexA均有高表达的菌株作用明显,而对金属酶阳性菌株无效。2.体外实验敏感与不敏感的菌株之间外排泵的表达量无差别,氨氯地平并不能影响泛耐药菌株外排泵基因的表达,可能只是通过抑制外排泵的活性达到抑菌的效果。3.对泛耐药铜绿假单胞菌感染后肺炎模型,联合应用体外单药药敏试验耐药的抗菌药后对细菌仍有一定的清除作用,但加入氨氯地平干预未显示有明显的治疗效应。