中药重楼皂苷的分离、结构鉴定及生物转化的研究

论文摘要

本论文研究了新月弯孢霉（Curvularia lunata 3.4381）生物转化重楼甾体皂苷单体PI的生物反应,得到的新化合物以达到减毒作用。考察了重楼皂苷提取分离纯化的最佳工艺以及重楼皂苷的体外药理活性,并讨论了重楼皂苷化合物的结构-药效关系,重点从可转化甾体化合物的菌种中筛选出新月弯孢霉,该菌可对重楼皂苷PI选择性的进行水解,从而到达减毒的目的。此外对新月弯孢霉的培养基进行优化。首先,通过正交试验确定重楼总皂苷的提取工艺,同时对比了7种不同型号的大孔吸附树脂的静态吸附条件,确定采用树脂的型号。重楼总皂苷的提取工艺为在微沸状态下,4倍量的70%乙醇,2h／次回流提取3次。经过验证实验,皂苷提取率达到80.80%,工艺稳定,重现性好。通过静态吸附条件的考察确定选用HP-20型号树脂,并确定了该树脂的动态条件pH自然的条件下,按3：1的上样量以2 Bv／h流速进行吸附,吸附完全后先用10%-20%的乙醇先洗脱除杂,再用70%的乙醇洗脱得到重楼总皂苷。其次,通过提取出来的6种甾体类皂苷,讨论了重楼皂苷化合物的结构-药效关系。皂苷元C-3位连接糖链时,糖的数目、连接位置及组成类型对其生物活性都起着至关重要的作用,其中化合物1-4是由葡萄糖和鼠李糖组成糖链,末端鼠李糖连接在葡萄糖的2位时,细胞毒活性明显强于连在4位上；此外,从组成皂苷的糖的类型上看,糖链数目相同的情况下,含有鼠李糖较多的皂苷细胞毒活性更强一些。再次,重点对可转化重楼皂苷PI的菌种进行了筛选了。选用了黑根酶、赭曲霉、雷斯青霉、简单节杆菌和新月弯孢霉对重楼皂苷PI进行生物转化,通过HPLC发现新月弯孢霉可对重楼皂苷PI发生生物转化反应,转化产物经过C-NMR、H-NMR确定水解掉了C-3鼠李糖。通过药理作用证明了产物较重楼皂苷PI细胞毒活性有明显的降低。最后,通过单因素试验对新月弯孢霉摇瓶转化培养基优化,确定了转化培养基的最适碳源为蔗糖,最适氮源为酵母膏和硫酸铵。通过响应面确定培养基优化条件,即蔗糖浓度为7.847g／L；酵母膏的浓度为1.969g／L；硫酸铵的浓度为4.824 g／L；玉米浆的浓度为11.81 g／L,拟合出最佳的转化率为77.18%。通过正交试验确定了新月弯孢霉的发酵转化条件,即在pH 6.3的状态下,按2%接种量,装液量为250 mL三角瓶装液40 mL,0.2%的底物浓度,转化温度为30℃,采用HP-β-CD的投料方式进行转化。经验证,最终的转化率可达88.13%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 中药重楼研究进展
• 1.1.1 中药重楼简介
• 1.1.2 重楼化学成分的研究
• 1.1.3 重楼药理作用的研究
• 1.1.4 重楼临床作用的研究
• 1.2 中药重楼抗肿瘤作用的研究
• 1.2.1 重楼抗肿瘤作用的研究
• 1.2.2 重楼抗肿瘤作用机制
• 1.2.3 重楼抗肿瘤的研究
• 1.3 中药成分生物转化
• 1.3.1 中药成分生物转化的意义
• 1.3.2 中药成分生物转化的应用
• 1.3.3 微生物转化中药和天然药物的原理和优点
• 1.3.4 微生物转化中药和天然药物的研究现状
• 1.3.5 中药成分生物转化的研究趋势
• 1.3.6 生物转化的反应类型
• 1.4 本课题的主要研究内容及意义
• 1.4.1 本课题研究意义
• 1.4.2 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种及植物来源
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.2 重楼总皂苷的提取
• 2.2.1 总皂苷标准曲线的绘制
• 2.2.2 总皂苷提取的正交试验
• 2.2.3 总皂苷提取的验证实验
• 2.3 大孔吸附树脂分离纯化重楼总皂苷
• 2.3.1 不同型号大孔吸附树脂对重楼总皂苷静态吸附量的考察
• 2.3.2 HP-20树脂动态吸附性能考察
• 2.4 重楼总皂苷单体的分离纯化及结构鉴定
• 2.4.1 重楼皂苷单体PI的分离
• 2.4.2 滇重楼有效成分的提取分离及纯化
• 2.5 中药重楼皂苷的药理学研究
• 2.5.1 细胞株及培养
• 2.5.2 药物抗肿瘤活性的测定
• 2.6 中药重楼皂苷单体PI的生物转化研究
• 2.6.1 黑根酶对重楼皂苷的转化
• 2.6.2 赭曲霉对重楼皂苷的转化
• 2.6.3 简单节杆菌对重楼皂苷的转化
• 2.6.4 雷斯青霉对重楼皂苷的转化
• 2.6.5 新月弯孢霉对重楼皂苷的转化
• 2.7 新月弯孢霉对重楼皂苷发酵条件的优化
• 2.7.1 菌种生长曲线的测定
• 2.7.2 转化培养方式
• 2.7.3 培养基转化条件优化
• 2.7.4 发酵条件的优化
• 2.7.5 转化率的测定
• 2.8 反应介质对重楼皂苷生物转化反应的影响
• 2.8.1 有机溶剂介质的影响
• 2.8.2 表面活性剂活性介质的影响
• 2.8.3 环糊精的影响
• 2.8.4 对照实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 重楼总皂苷分离提取、纯化
• 3.1.1 总皂苷标准曲线的绘制
• 3.1.2 重楼总皂苷提取的正交试验
• 3.1.3 大孔吸附树脂分离纯化重楼总皂苷
• 3.2 重楼皂苷单体的结构鉴定
• 3.2.1 重楼皂苷单体PI的分离提取及结构鉴定
• 3.2.2 其他重楼皂苷的分离及结构解析与鉴定
• 3.3 重楼皂苷药理作用的研究
• 3.4 微生物对重楼皂苷PI的转化作用
• 3.4.1 转化重楼皂苷PI菌株的选择
• 3.4.2 转化后产物结构鉴定
• 3.5 转化前后的化合物抑制肿瘤作用的比较
• 3.6 新月弯孢霉对重楼皂苷发酵条件的优化
• 3.6.1 新月弯孢霉生长曲线的测定
• 3.6.2 培养基条件优化
• 3.6.3 发酵条件优化
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读学位期间所发表的论文
• 8 致谢
• 附录