论文摘要
目的：研究胃癌中可调节组蛋白去甲基化酶RBP2表达的特定MicroRNA,进而研究其对RBP2表达以及胃癌细胞增殖的影响和作用机制。方法：利用生物信息学方法,在TargetScan, miRanda和miRBase等miRNA数据库中分别预测能够靶向调节RBP2的miRNA;将各数据库预测结果进行聚类分析,寻找在各个数据库中均存在的特定miRNA作为研究对象。在19对中国人胃原位癌及对应的癌旁正常组织中分别利用QRT-PCR和免疫组化法检测miR-212和RBP2的表达情况。利用分子克隆的方法分别构建miR-212高表达质粒pS-miR-212、抑制niR-212表达质粒anti-miR-212、荧光素酶报告质粒pMIR-REPORT/RBP2/3’UTR以及三种突变荧光素酶报告质粒pMIR-REPORT/RBP2/3’UTR mutantl（结合区1突变）,2（结合区2突变）,3（结合区1,2均突变）。利用脂质体将pS-miR-212、anti-miR-212以及两者的对照质粒分别转染到AGS,BGC-823和GES-1细胞中,转染48小时后利用Trizol提取其总RNA。利用miR-212特异RT及PCR引物分别进行逆转录和荧光定量PCR来检测各质粒对胃癌细胞miR-212表达的调控作用。为了确定miR-212是否靶向调节胃癌细胞中RBP2表达,逆转录后,利用荧光定量PCR和Western blotting检测各组中RBP2的mRNA和蛋白表达情况。为了确定预测获得的RBP2 3’UTR上的miR-212结合位点是否参与调节RBP2的表达,我们进行了荧光素酶报告基因分析。将pMIR-REPORT/RBP2/3’UTR,3种突变荧光素酶报告质粒及pMIR-REPORTβ-gal对照质粒分别和pS-miR-212或其对照质粒共转染入GES细胞中。分别测定其荧光素酶活性。为了确定miR-212对p21CIP1和p27kip1表达的影响,将pS-miR-212、anti-miR-212以及两者的对照质粒分别转染AGS、BGC-823和GES-1细胞。转染48小时后利用荧光定量PCR检测p21CIP1和p27kip1mRNA表达情况。为了研究miR-212靶向调控RBP2的生物学效应,我们使用AGS和GES-1细胞进行克隆形成实验。将pS-miR-212、anti-miR-212以及两者的对照质粒分别转染AGS和GES-1细胞,在孵箱中培养7-10天。经固定,染色后计数克隆数。结果：经过对在不同数据库中搜索得到的结果进行比对,发现miR-212最有可能结合到RBP2的3’UTR区域。RBP2的3’UTR区域含有两个miR-212的潜在结合位点。与相应的癌旁正常组织相比,在胃癌组织中,miR-212表达下降,RBP2异常高表达。各种质粒经测序验证,插入序列正确,质粒构建成功。细胞转染pS-miR-212质粒后,miR-212表达量与对照细胞相比明显上升。细胞转染anti-miR-212质粒后,miR-212表达量与对照细胞相比明显下降。在转染pS-miR-212质粒的细胞中,RBP2的mRNA和蛋白水平明显下降。在转染anti-miR-212质粒的细胞中,RBP2的mRNA和蛋白水平明显上升。以上结果表明,在胃癌细胞中miR-212通过影响RBP2 mRNA的稳定性来抑制RBP2表达。转染了pS-miR-212的细胞中的荧光素酶活性与转染空对照的细胞相比明显下降,表明miR-212通过直接结合到RBP2的3’UTR区域来调节RBP2表达。转染miR-212结合位点单突变荧光素酶报告质粒会减弱miR-212介导的荧光素酶活性降低,而转染miR-212结合位点双突变荧光素酶报告质粒会完全消除miR-212介导的荧光素酶活性降低,表明miR-212能够直接结合到RBP2的3’UTR区域的两个miR-212潜在结合位点,从而调节RBP2的表达。在转染pS-miR-212的细胞中,p21CIP1和p27kip1的mRNA水平上升。而在转染anti-miR-212的细胞中,p21CIP1和p27kip1的mRNA水平下降。miR-212能够影响胃癌细胞的克隆形成能力。与对照相比,转染pS-miR-212的细胞克隆数量减少而转染anti-miR-212的细胞克隆数量上升。结果表明,在体外,miR-212抑制人胃癌细胞增殖。结论：在本研究中,miR-212被确定为能够调节RBP2表达的特异MicroRNA。与相应的癌旁正常组织相比,在胃癌组织中,miR-212表达下降,RBP2异常高表达。在胃癌细胞中,miR-212通过直接结合RBP2的3’UTR特定区域对RBP2的蛋白表达进行负调节,影响细胞周期关键调控蛋白p21CIP1和p27kip1的表达,从而显著抑制胃癌细胞增殖。