反义rca水稻光合特性及其Rubisco和Rubisco活化酶的亚细胞定位

论文摘要

Rubisco作为催化光合碳循环和光呼吸的第一步反应的酶，在调节光合速率中发挥关键作用，该酶需要进行氨甲酰化并与Mg2+结合才具有催化活力。目前公认的看法是该酶在体内的活化需要Rubisco活化酶（RCA）的促进，RCA通过释放Rubisco活化位点上的磷酸糖抑制物，促进Rubisco的氨甲酰化。为了进一步研究RCA在调节Rubisco和光合作用中的作用，我们通过反义RNA技术获得反义rca水稻，并研究RCA含量的降低对光合作用、能量耗散、Rubisco和RCA的细胞定位的影响，结果摘要如下： 利用pGEM-T easy、pBluescript KS+获得了RCA基因两端可以引入与双元表达载体pCAMBIA1301多克隆位点相匹配的单酶切位点，将该片段连接到pCAMBIA1301载体，构建了RCA基因的反义植物表达载体pCAMR02。通过电激法将该载体导入根癌农杆菌EHA105菌株，以根癌农杆菌介导的方法，将反义载体pCAMR02转化粳稻品种中花11，获得了抗潮霉素的再生植株，经过GUS组织化学检测和PCR鉴定，明确目的基因已经整合到这些转基因水稻基因组中。表型测定显示，有大部分反义植株在大气CO2浓度下很难生长或不能生长，部分与野生型的长势基本相同，部分存活下来转化株生长缓慢。 研究表明，只有RCA含量低于野生型的35％的植株才能引起稳态光合速率的明显下降。因此，我们选择RCA含量为野生型15—30％的反义植株进行研究，这些反义水稻能在大气CO2浓度下生长，但相对于野生型水稻，生长比较缓慢。气体交换特性测定发现与野生型水稻相比，反义植株的净光合速率（Pn）明显下降，但气孔导度（gs）和蒸腾速率（E）不变，胞间CO2浓度（Ci）明显高于野生型水稻，这说明反义水稻Pn的下降不是由于气孔导度引起的。另外，这些转基因植株的Rubisco初始活力和最大羧化速率(Vcmax)明显下降，但Rubisco含量和总活力却显著上升。因此，RCA含量的降低影响了Rubisco氨甲酰作用是光合速率下降的主要原因，而Rubisco含量的上升可能是对RCA含量下降，导致Rubisco氨甲酰作用下降引起酶活性降低的一种补偿反应。 反义rca水稻的叶肉导度大大低于野生型水稻，但是Rubisco羧化位点的CO2浓度（Cc）却明显高于野生型水稻，表明其光合速率和Vcmax)的下降不是由

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述与研究意义
• 第一节 研究目的意义和内容
• 1 选题背景
• 2 研究意义
• 3 研究内容与目标
• 3.1 水稻rca的转基因研究
• 3.2 反义rca转基因水稻的光合生理生化研究
• 3.3 反义rca转基因水稻的RCA和Rubisco亚细胞定位
• 第二节 Rubisco活化酶研究进展
• 1 RCA的发现
• 2 RCA的结构
• 2.1 亚基组成及氨基酸序列
• 2.2 RCA的立体结构
• 3 RCA与Rubisco的相互作用
• 3.1 Rubisco和RCA的细胞定位
• 3.2 Rubisco的钝化和活化
• 3.3 RCA活化Rubisco的作用机制
• 4 RCA活力的调控
• 4.1 ADP／ATP比例对RCA活力的调控
• 4.2 硫氧还蛋白-f介导的氧化还原RCA活力的调控
• 5 热胁迫对RCA的影响
• 5.1 热胁迫下RCA和Rubisco的相互关系
• 5.2 热胁迫对RCA结构及其亚基影响
• 5.3 热胁迫下RCA的基因表达
• 5.3.1 热胁迫下新RCA多肽的形成
• 5.3.2 热胁迫RCA的转录及调控
• 6 RCA与光合作用
• 6.1 RCA与光合作用的关系
• 6.2 RCA基因工程与光合作用
• 6.3 RCA在调节非稳态光合作用中的作用
• 第二章 Rubisco活化酶基因反义表达载体的构建与水稻的遗传转化
• 1 材料和方法
• 1.1 供试水稻材料
• 1.2 RCA全长基因、质粒和菌种
• 1.3 酶和试剂
• 1.4 PCR引物设计
• 1.5 rca基因的克隆与测序
• 1.6 反义rca载体的构建方法
• 1.6.1 质粒DNA的酶切
• 1.6.2 琼脂糖凝胶电泳
• 1.6.3 DNA片断的回收
• 1.6.4 连接反应
• 1.6.5 连接产物的转化
• 1.6.6 重组克隆的筛选和鉴定
• 1.6.7 植物表达载体的农杆菌转化
• 1.6.8 农杆菌转化子的酶切鉴定
• 1.6.9 重组转化子的PCR鉴定
• 1.7 根癌农杆菌介导的遗传转化和转基因植株再生
• 1.7.1 水稻愈伤组织的诱导
• 1.7.2 农杆菌培养
• 1.7.3 共培养和抗性愈伤组织的选择
• 1.7.4 抗性愈伤组织的预分化
• 1.7.5 抗性愈伤组织的诱导分化和生根
• 1.7.6 转基因苗的锻炼和移栽
• 1.8 GUS活性的组织化学检测
• 1.9 DNA的提取与PCR鉴定
• 1.9.1 水稻DNA的提取
• 1.9.2 转基因水稻的PCR检测
• 1代转化水稻的筛选与种植'>1.10 T₁代转化水稻的筛选与种植
• 1.11 反义转基因植株表型测定
• 2 结果与分析
• 2.1 含rca基因的克隆与产物鉴定
• 2.2 rca／EcoRI片段与pBluescript SK（pBS）载体连接
• 2.3 rca／BamHI片段与pCAMBIA 1301连接
• 2.4 pCAMBIA 1301-rca质粒的EcoRⅠ酶切鉴定片段连接方向
• 2.5 pCAMR02转化农杆菌EHA105并酶切鉴定
• 2.6 农杆菌法转化水稻成熟胚愈伤组织及植株的再生
• 2.7 RCA反义转基因株的分子检测
• 2.7.1 转基因株水稻幼苗GUS组织化学分析
• 2.7.2 转基因株的PCR鉴定
• 2.8 反义rca水稻的表型
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌转基因方法的转化效率
• 3.2 反义rca水稻对研究RCA与Rubisco互作有重要意义
• 第三章 反义rca水稻的Rubisco活化和气体交换特性
• 1 材料和方法
• 1.1 水稻种植与管理
• 1.2 气体交换参数的测定
• 1.3 RCA含量测定
• 1.4 Rubisco含量和活力测定
• 1.5 可溶性蛋白含量测定
• 1.6 统计方法
• 2 结果和分析
• 2.1 RCA含量与光合速率
• 2.2 Rubisco和可溶性蛋白含量,以及Rubisco活力的变化
• 2.3 反义rca突变体的光合速率和气孔因素
• 3 讨论
• 第四章 Rubisco活化酶含量减少对水稻叶肉导度和光合电子传递的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与培养
• 1.2 色素含量的测定
• 1.3 碳酸酐酶（CA）总活力测定
• 1.4 气体交换和叶绿素荧光参数的测定
• 1.5 P700氧化还原状态的测定
• 1.6 ATP含量的测定
• 1.7 统计方法
• 2 结果与分析
• 2响应曲线'>2.1 反义RCA水稻的CO₂响应曲线
• 2.2 色素含量和CA活力
• 2.3 反义RCA水稻的叶绿素荧光特性
• 2.4 RCA含量减少对作用光关闭后叶绿素荧光瞬时上升的影响
• 2.5 RCA含量减少对水稻叶片P700氧化还原变化的影响
• 2.6 RCA含量减少对水稻叶片中ATP含量的影响
• 2.7 RCA含量降低对水稻光抑制的影响
• 3 讨论
• 3.1 叶肉导度
• 3.2 类囊体酸化与电子传递
• 第五章 Rubisco活化酶含量的减少对水稻叶片细胞中Rubisco和Rubisco活化酶的免疫定位的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试植物材料
• 1.2 RCA含量测定
• 1.3 气体交换参数测定
• 1.4 Rubisco含量与活力测定。
• 1.5 Rubisco和RCA抗体制备
• 1.6 免疫胶体金标记
• 1.6.1 低温包埋
• 1.6.2 样品超薄切片
• 1.6.3 切片胶体金标记
• 1.6.4 切片染色
• 1.6.5 超薄切片的电镜观察
• 1.6.6 胶体金标记形态定量
• 2 结果与分析
• 2.1 反义水稻的Rubisco含量和活力,以及气体交换参数
• 2.2 Rubisco的细胞定位
• 2.3 RCA的细胞定位
• 3 讨论
• 第六章 全文讨论与总结
• 1 讨论
• 1.1 RCA对Rubisco的调节作用
• 1.2 RCA含量下降对气孔导度和叶肉导度的影响
• 1.3 RCA含量下降增加了PSI环式电子流
• 2 本研究结论与创新点
• 3 未来可能的研究动态
• 3.1 新兴技术的引入
• 3.2 RCA与外界环境的互作机理探索
• 3.3 RCA基因工程提高光合作用的可能性
• 3.4 RCA多功能性研究
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 附录Ⅲ
• 附录Ⅳ
• 致谢