论文摘要
产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing E. coli, STEC）是一群重要的肠道致病菌,能引起一系列人类疾病,包括水样腹泻（watery diarrhea）、出血性肠炎（hemorrhagic colitis, HC）、溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome, HUS）。由STEC引起的消化道疾病在世界各地的暴发显示,这一类病原菌已成为威胁人类健康的重要致病菌。至今,能引起人类疾病的STEC除主要血清型0157：H7外,其他的血清型如015、O26、045、O111、0145等也常见。西班牙、德国、澳大利亚对HUS病人的多项调查显示,STEC026:H11是最常见的病原菌。本研究的目的是进行STEC026特异性单克隆抗体的研制,为建立STEC026的病原检测方法奠定基础。本研究以STEC XZ266（O26:H11）的灭活全菌作为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得杂交瘤细胞株。提取了STEC XZ266（O26:H11）及STEC EDL933W （O157:H7）的LPS,纯化、鉴定后分别作为抗原包被酶标板,对杂交瘤细胞进行筛选,同时用STEC XZ266（026:H11）及STEC EDL933W （0157:H7）全菌包被酶标板和直接玻板凝集对杂交瘤细胞进行筛选,获得5株稳定分泌抗STEC026的杂交瘤细胞株,分别命名为1C10、3D7、4A8、4G11、5B5。其中1C10、585与026全菌和026LPS均发生反应,同时直接玻板凝集也为阳性;3D7与026全菌和026LPS均发生反应,但直接玻板凝集为阴性；4A8和4G11仅与026全菌发生反应,同时直接玻板凝集也为阳性。总体来说,这5株单克隆抗体均与026全菌发生反应,效价分别为1：256000、1：102400、1：256000、1：128000、1：128000。特异性分析表明,单抗4G11除与牛场分离的STEC O2、STEC O81和羊场分离的STEC O39、STEC O93发生交叉反应外,与其他血清型的STEC无交叉反应,其他四株单克隆抗体则不与受试的其他血清型STEC发生交叉反应,具有高度特异性和敏感性。单克隆抗体1C10、4A8、4G11的抗体亚类为IgG2a,3D7为IgG2b,5B5为IgM。单抗亲和层析法纯化后,抗体非特异条带消失,抗体含量在1.1mg/mL～1.6mg/mL。以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用30nm胶体金标记单克隆抗体4A8制备金标探针,分别以单克隆抗体1C10和羊抗鼠IgG作为硝酸纤维素膜上的检测线和质控线,组装胶体金试纸条,并对试纸条的检测效果进行评价。结果显示,抗体与胶体金结合的最佳pH为8.5,用蛋白浓度梯度法确定胶体金与单抗最佳结合浓度为16μg/ML。试纸条操作简单,用肉眼15mmin内可判定结果,对STEC O26具有高度特异性,与其他血清型STEC没有交叉反应。试纸条可检出STEC O26的最低浓度为1×107CFU/mL。试纸条在室温保存1个月,其特异性及灵敏度无明显变化。用已建立的STEC O26免疫层析法对江苏省某奶牛场的67份粪样进行检测,并与直接凝集试验结果比较,计算得出免疫层析法和直接凝集试验结果的阳性符合率为50%（2/4）,阴性符合率为96.9%（63/65）,总体符合率为97.0%[（2+63）/67]。上述结果表明,本研究建立的STEC O26胶体金免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合用于STEC O26的现场检测及鉴别诊断。
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标签：产志贺毒素大肠杆菌论文; 脂多糖论文; 单克隆抗体论文; 胶体金论文; 试纸条论文;