论文摘要
背景与目的：恶性肿瘤产生的多药耐药（multidrug-resistance，MDR）已成为当前影响肿瘤化学治疗疗效的主要障碍。多药耐药性是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉抗药性，从而大大降低了抗肿瘤药物的疗效。MDR产生机制复杂，其中由MDR1基因编码的P-gp（P-glycoprotein，P-gp）的过度表达是产生MDR的主要原因。RNAi（RNA interference，RNAi）是近年来兴起的一种基因技术，指在广泛的生物范围内都存在的由dsRNA（double stranded RNA，dsRNA）介导的同源基因表达受抑制的现象，使内源性mRNA发生特异性降解，代替了传统反义核酸进行转录后基因沉默。本研究探讨体外和体内转染小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）后对人神经胶质瘤细胞U251和裸鼠人肺癌移植瘤的多药耐药性的影响。方法：在GeneBank中找出人多药耐药基因的mRNA序列，利用Invitrogen公司的RNA在线工具，设计了2对靶向多药耐药基因（MDR1）的干扰序列MDR1siRNAs和1对非特异siRNA，并进行Blast比对排除同源性。利用化学合成法得到干扰序列，体外与阳离子脂质体构建转染复合体，转染至U251细胞株，然后在转染后24 h和48 h采用逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和Western blot检测细胞中MDR1 mRNA和P-gp蛋白的表达情况，为了检测转染后的细胞对化疗药物的耐药情况，我们将转染后的细胞与临床常用的耐药的化疗药物进行共培养，然后采用MTT法进行检测，计算抑制率（inhibition rate，IR）=（1-实验组平均A值／对照组平均A值）×100％；为了进一步探讨MDR1siRNA的体内干扰效果，我们构建了裸鼠人肺癌移植瘤模型，联合运用活体电穿孔和瘤内注射转染技术，将MDR1siRNA转染入移植瘤内，并设计了不同的转染剂量组（0.5nmol／150mm3、1nmol／150mm3、2nmol／150mm3、3nmol／150mm3），在转染后48 h提取瘤组织，RT-PCR和immunohistochemistry检测肿瘤中MDR1 mRNA和P-gp的表达情况；为了进一步研究转染MDR1siRNA后，肿瘤对化疗药物的耐药情况，我们在转染后48 h开始腹腔注射给予裸鼠抗肿瘤药物长春瑞滨（Vinorelbine Bitartrate，NVB）治疗（5mg／kg／w），转染后每两天测量一次肿瘤的长径和短径，根据公式V=лab2／6计算肿瘤的体积，绘制出肿瘤的生长曲线，并在最后一次给药后2天，处死裸鼠，取出瘤块进行称重，然后根据公式IR=（1-实验组的平均瘤重／对照组平均瘤重）×100％计算抑瘤率。结果：细胞内转染MDR1siRNA后，RT-PCR和Western blot结果显示MDR1 mRNA和P-gp的表达较未转染组明显下降，药敏结果显示细胞内转染MDR1siRNA后，逆转了细胞对长春新碱（Vincristine，VCR）、卡莫斯汀（Becenun，BCNU）、司莫司汀（Me-CCN）的耐药（IR＞30％），增强了细胞对紫杉醇（Pacilitaxel，PTX）、表柔比星（Epirubicin，EPI）的敏感性（IR＞50％）；裸鼠人移植瘤内转染MDR1siRNA后，RT-PCR和immunohistochemistry结果显示低剂量转染时仅能轻度抑制肿瘤中MDR1mRNA和P-gp的表达，随着转染剂量的增加，抑制作用逐渐增强，至2nmol／150mm3时，抑制作用达到最大，当继续增加剂量时，表达未见继续降低，说明活体转染MDR1siRNA后能有效抑制MDR1mRNA和P-gp的表达，且其抑制作用呈现出一定的剂量依赖性。同时瘤内转染MDR1siRNA后给予NVB（5mg／kg／w，i.p.），结果显示肿瘤的生长显著减慢，NVB的抑瘤率明显提高，而对未转染MDR1siRNA的肿瘤的生长没有表现出明显抑制，说明活体转染siRNA后恢复了肿瘤对抗肿瘤药物的敏感性，增强了抗肿瘤药物的抑瘤率。结论：细胞内和裸鼠人移植瘤内转染特异性的MDR1siRNA后能明显降低MDR1 mRNA和P-gp的表达，恢复细胞和肿瘤对抗肿瘤药物的敏感性，逆转了细胞和移植瘤的多药耐药性。