论文摘要
研究目的:探讨幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）对胃上皮Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）信号通路的影响及其在Hp致病中的作用,以阐明胃黏膜对Hp的识别和引起炎症反应的机制,为下一步通过调节TLRs信号通路来防治Hp感染及其相关性疾病的研究奠定实验基础,为Hp相关性疾病的防治提供理论和实验依据。研究方法:⑴TLR4信号通路在Hp感染胃黏膜中的变化的研究:①采用SP免疫组化方法检测了189例胃镜活检的胃黏膜内TLR4的表达。其中慢性非萎缩性胃炎（CNAG）75例（Hp阳性50例,Hp阴性25例）,慢性萎缩性胃炎（CAG）24例（Hp阳性13例,Hp阴性11例）,肠化与异型增生（IM+DYS）90例（Hp阳性45例,Hp阴性45例）,另取组织学大致正常且Hp阴性胃黏膜20例做正常对照。②30只清洁级Balb/C小鼠分为:正常对照组;Hp感染组:建立Hp感染模型后不给予任何治疗;Hp根除组:建立Hp感染模型后,给予洛赛克0.06 mg/次/只,羟氨苄青霉素2.9mg/次/只,壳聚糖12.5 mg/次/只。每日2次,共2周。未次给药后4周处死小鼠取胃黏膜,采用细菌培养和Geimsa染色检测Hp感染,用RT-PCR和免疫组织化学法检测胃黏膜内TLR4 mRNA和蛋白的表达。⑵Hp对人正常胃上皮细胞株GES-1内TLRs信号通路的影响:①分别以Hp培养上清和活菌作用正常胃上皮细胞GES-1,分为下几组:实验组A为不同浓度Hp培养上清（0.630μg/μl、0.315μg/μl、0.158μg/μl、0.079μg/μl）作用组,每组分别观察24h、48h和72h;实验组B为不同浓度Hp活菌（4.00×107CFU/ml、2.00×107CFU/ml、1.00×107CFU/ml、0.50×107CFU/ml）作用组,每组分别观察16h、24h、48h;另以仅加入Hp空白液体培养基为对照组。②用MTT法检测各组细胞生长抑制率。③用RT-PCR方法检测各组细胞TLR2、TLR4和MyD88 mRNA的表达。研究结果:⑴TLR4信号通路在Hp感染胃黏膜中的变化的研究:①在各组疾病中无论是在上皮细胞还是炎性细胞Hp感染者胃黏膜内TLR4的表达显著高于无Hp感染者（P<0.050.001）;②在Hp感染者中CagA阳性菌株感染者胃黏膜上皮和炎细胞内TLR4的表达均显著高于Hp阴性者和CagA阴性菌株感染者（P<0.010.001）,在炎细胞内CagA阴性菌株感染者TLR4表达高于Hp阴性者（P<0.05）,而在上皮细胞内TLR4表达的CagA阴性菌株感染者与Hp阴性者无差异（P>0.05）;③在小鼠Hp感染模型中Hp感染小鼠胃上皮细胞TLR4蛋白和mRNA表达均显著高于正常对照组（P<0.01）,而给予Hp根除后小鼠TLR4的表达显著降低（P<0.01）,与正常对照组无差别（P>0.05）。⑵Hp对人正常胃上皮细胞株GES-1内TLRs信号通路的影响:1)在Hp培养上清作用各实验组的生长抑制率显著高于对照组（P<0.001）,并且随着浓度的增加对GES-1细胞生长的抑制作用增加,在各时间段0.630μg/μl组的生长抑制率显著高于其它各浓度组（P<0.001）;在24h时0.315μg/μl组显著高于0.079μg/μl组（P<0.01）;在48h和72h时0.315μg/μl和0.158μg/μl浓度组显著高于0.079μg/μl组（P<0.0010.01）;在72h时0.158μg/μl组显著高于0.079μg/μl组（P<0.01）。2) Hp培养上清作用时间对GES-1细胞生长抑制率的显著影响,在0.315μg/μl、0.158μg/μl和0.079μg/μl浓度范围内Hp培养上清作用时间对GES-1细胞的生长抑制有显著差异（P<0.0010.05）。在0.315μg/μl和0.158μg/μl浓度时48h和72h组的抑制作用均显著高于24h组（P<0.0010.01）,以48h最强;在0.079μg/μl浓度时48h组的抑制作用显著高于24h组（P<0.01）;在各浓度时48h和72h组之间无差异,表明在48h时对细胞生长抑制作用已达高峰。在高浓度时（0.630μg/μl）各时间段的生长抑制作用无差异（P>0.05）。3)在Hp活菌作用各实验组的生长抑制率显著高于对照组（P<0.001）,并且随着细菌浓度的增加GES-1细胞的生长抑制率增加,在16h和24h时4×107CFU/ml组的生长抑制率显著高于其它各浓度组（P<0.001）,2×107CFU/ml组显著高于0.5×107CFU/ml组（P<0.01）;在48h时各浓度之间均的显著差异（P<0.0010.05）。4) Hp活菌作用时间对GES-1细胞生长抑制率的显著影响,随着Hp作用时间延长生长抑制率增加,在所有浓度时16h组的抑制率均显著低于24h和48h组（P<0.0010.01）,在2×107CFU/ml和1×107CFU/ml的浓度范围内24h组的生长抑制率还显著低于48h组（P<0.010.05）。5)不同浓度Hp培养上清对GES-1细胞内TLR4 mRNA的表达有显著差异（P<0.0010.05）,在各时间段以0.315μg/μl和0.158μg/μl组TLR4的表达最高,均显著高于对照组和0.630μg/μl组（P<0.050.001）,在48h和72h时还显著高于0.079μg/μl组（P<0.0010.01）,在24h时0.158μg/μl组TLR4的表达也显著高于0.630μg/μl组（P<0.05）,在48h时0.079μg/μl组TLR4的表达也显著高于0.630μg/μl组（P<0.05）;但不同作用时间组GES-1细胞内TLR4mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。6)不同浓度Hp活菌对GES-1细胞内TLR4mRNA的表达有显著差异（P<0.0010.05）,在各时间段4×107CFU/ml、2×107CFU/ml和1×107CFU/ml组均显著高于对照组（P<0.0010.05）,在16h时2×107CFU/ml组还显著高于1×107CFU/ml和0.5×107CFU/ml组（P<0.05）,在24h时0.5×107CFU/ml组也显著高于对照组（P<0.05）,在48h时4×107CFU/ml和2×107CFU/ml组还显著高于0.5×107CFU/ml组（P<0.05）;但不同作用时间组GES-1细胞内TLR4mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。7)不同浓度Hp培养上清对GES-1细胞内TLR2mRNA的表达有显著差异（P<0.001）,在各时间段以0.315μg/μl和0.158μg/μl组TLR2的表达最高,均显著高于对照组、0.630μg/μl组和0.079μg/μl组（P<0.001）;但不同作用时间组GES-1细胞内TLR2mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。8)不同浓度Hp活菌对GES-1细胞内TLR2mRNA的表达有显著差异（P<0.0010.05）,在各时间段4×107CFU/ml、2×107CFU/ml和1×107CFU/ml组TLR2的表达均显著高于对照组（P<0.0010.05）,4×107CFU/ml组还显著高于0.5×107CFU/ml组（ P<0.010.05 ） ,在48h时2×107CFU/ml组显著高于0.5×107CFU/ml组（P<0.01）;但不同作用时间组GES-1细胞内TLR2mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。9)不同浓度Hp培养上清对GES-1细胞内MyD88mRNA的表达有显著差异（P<0.05）,在24h时0.630μg/μl和0.315μg/μl组MyD88的表达均显著高于对照组和0.079μg/μl组（P<0.010.05）;在48h时0.630μg/μl组MyD88的表达显著高于对照组、0.315μg/μl和0.158μg/μl组（P<0.01）;在0.158μg/μl浓度时48h组显著高于24h组（P<0.01）其它各浓度时不同作用时间组GES-1细胞内MyD88mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。10)不同浓度Hp活菌对GES-1细胞内MyD88mRNA的表达有显著差异（P<0.0010.05）,在24h时4×107CFU/ml和2×107CFU/ml组MyD88mRNA的表达均显著高于0.5×107CFU/ml组和对照组（P<0.010.05）;在48h时4×107CFU/ml和2×107CFU/ml组均显著高于对照组（P<0.01）,4×107CFU/ml组还显著高于1×107CFU/ml和0.5×107CFU/ml组（P<0.010.05）;但不同作用时间组GES-1细胞内MyD88mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。11) Hp培养上清作用组TLR2和TLR4 mRNA表达之间有显著相关性（P<0.0010.01）;但二者与MyD88之间无相关性（P>0.05）。在Hp活菌作用组,TLR2、TLR4和MyD88三者之间mRNA的表达均有显著相关性（P<0.0010.05）。结论:⑴Hp感染患者和小鼠胃黏膜内TLR4表达均显著上调,而Hp根除后TLR4表达下降,提示Hp可上调TLR4的表达,其可能通过TLR4信号通路诱导炎症反应。⑵Hp培养上清和活菌均能以时间和浓度依赖的方式抑制胃粘膜上皮细胞GES-1生长,这可能是Hp导致胃黏膜损伤的机制之一。⑶Hp培养上清和活菌均可上调人正常胃上皮细胞GES-1内TLR2、TLR4和MyD88 mRNA的表达,表明它们可以激活胃上皮细胞内TLRs信号通路,这可能是胃黏膜对Hp的识别和引起炎症反应的机制之一。
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