猪皮胶原蛋白酶解液的抗氧化活性及其分离纯化研究

论文摘要

本论文以猪皮为原料提取胶原蛋白,用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase2.4L碱性蛋白酶通过酶解制备胶原蛋白酶解产物,以水解度（DH）和超氧阴离子自由基清除率为指标,根据单因素和正交试验优化酶解条件；在此基础上,对最佳酶解条件下的胶原蛋白酶解产物的抗氧化性进行了研究,同时探讨了胶原蛋白酶解产物抗氧化性的稳定性；利用超滤、离子交换色谱以及凝胶过滤色谱等系列分离纯化技术从最佳酶解条件下的猪皮胶原蛋白酶解产物中分离纯化抗氧化活性肽。菠萝蛋白酶的水解条件优化结果：时间5h、温度45℃、pH3.5、酶与底物比4000 U/g、底物浓度6%,此时水解度为5.25%,O2-·清除率为44.49%；木瓜蛋白酶的水解条件优化结果：时间6h、温度70℃、pH5.5、酶与底物比6250U/g、底物浓度6%,此时水解度为13.28%,O2-·清除率为41.97%；Alcalase的水解条件优化结果：时间4h、温度55。C、pH7.5、酶与底物比6000 U/g、底物浓度4%,此时水解度为9.55%,O2-·清除率为60.11%。Alcalase酶解后的产物抑制O2-·自由基活性最强。用Alcalase最佳酶解工艺水解猪皮胶原所得酶解液的体外抗氧化活性测定结果显示：在10 mg/mL-50 mg/mL浓度范围内,该酶解液对·OH具有一定的清除作用,·OH最大清除率为56.38%, IC50=40.99mg/mL; DPPH·最大清除率为95.06%,IC50=3.89mg/mL; O2-·最大清除率为65.89%,IC50=16.43mg/mL;同时该酶解液具有一定的还原能力和抗脂质过氧化能力。总体而言,猪皮胶原蛋白酶解液采用不同的抗氧化活性检测方法进行检测都表现出一定的体外抗氧化效果。猪皮胶原蛋白酶解产物抗氧化性对热（100℃,10min）、冷冻（-18℃,24h）基本稳定,且在酸性环境中的抗氧化性优于在碱性环境中。猪皮胶原酶解液经截流分子量为lOkDa、5kDa、3kDa、2kDa的超滤膜分离后,得到了大于lOkDa、5kDa-10kDa、3kDa-5kDa、2kDa-3 kDa和小于2kDa的5个分子量肽段的组分,其中,分子量<2 kD的组分清除O2-·活性最高,多肽浓度为2.24 mg/mL时,清除率为41.11%,IC50值为2.85mg/mL。猪皮胶原蛋白酶解物经过SP-Sephadex C-25离子交换层析得到了7个新组分P1-P7。其中第1个峰P1峰的O2-·清除活性最高,多肽浓度为0.85 mg/mL时,清除率为46.30%,组分P1清除O2-·的IC50值为1.24 mg/mL。组分P1经过凝胶SephadexG-25层析柱后得到2个峰,其中第2个峰P1-B峰的O2-·清除活性最高,多肽浓度为0.9mg/mL时,清除率为49.43%,IC50值为0.98mg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 立题背景、研究意义
• 1.2 胶原蛋白
• 1.2.1 胶原蛋白的结构及性质
• 1.2.2 国内外胶原蛋白的研究现状
• 1.3 胶原多肽的生理功能
• 1.4 胶原多肽的制备方法
• 1.5 抗氧化肽抗氧化活性的检测方法
• 1.6 试验内容及目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 猪皮胶原蛋白的提取
• 2.2.2 猪皮胶原蛋白的酶解
• 2.2.3 猪皮胶原蛋白酶解液的体外抗氧化活性研究
• 2.2.4 猪皮胶原蛋白酶解液抗氧化性的稳定性研究
• 2.2.5 猪皮胶原蛋白酶解液的分离
• 2.2.6 测定方法
• 2.2.7 数据处理与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 猪皮胶原蛋白酶解液的制备
• 3.1.1 菠萝蛋白酶最佳酶解条件的确定
• 3.1.2 木瓜蛋白酶最佳酶解条件的确定
• 3.1.3 Alcalase最佳酶解条件的确定
• 3.1.4 三种蛋白酶水解效果的比较
• 3.2 猪皮胶原蛋白酶解产物的体外抗氧化活性
• 3.2.1 猪皮胶原蛋白酶解产物对超氧阴离子自由基的清除能力
• 3.2.2 猪皮胶原蛋白酶解产物对羟基自由基的清除能力
• 3.2.3 猪皮胶原蛋白酶解产物的还原能力
• 3.2.4 猪皮胶原蛋白酶解产物的抗脂质过氧化能力
• 3.2.5 猪皮胶原蛋白酶解产物对DPPH自由基的清除能力
• 3.3 猪皮胶原蛋白酶解液抗氧化性的稳定性研究结果
• 3.4 猪皮胶原蛋白酶解液的分离实验结果
• 3.4.1 胶原蛋白酶解液的超滤分离结果
• 3.4.2 胶原蛋白酶解液的离子交换色谱SP-Sephadex C-25分离结果
• 2^-·的活性最强组分的凝胶过滤色谱分离结果'>3.4.3 抑制O₂^-·的活性最强组分的凝胶过滤色谱分离结果
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 关于猪皮胶原蛋白的酶解
• 4.1.2 关于猪皮胶原蛋白酶解产物的抗氧化活性
• 4.1.3 关于猪皮胶原蛋白酶解液的分离与纯化
• 4.2 结论
• 5 问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表文章