鸡胸软骨Ⅱ型胶原的制备及功能性研究

论文摘要

鸡骨是肉鸡加工的主要副产物,目前大量鸡骨没有得到充分的开发和利用,而是当作废弃物抛弃,造成极大的浪费,且污染环境。Ⅱ型胶原是鸡胸软骨中的主要成分,Ⅱ型胶原独特的结构和功能使其广泛应用于食品、医药及化工等领域。从鸡胸软骨中提取Ⅱ型胶原,不但充分利用了鸡骨资源,减少环境污染,解决了家禽加工资源综合利用的问题,同时也可以得到一种具有高附加值的生物活性物质,具有很大的理论意义和实用价值。本课题采用酶法从鸡胸软骨中制备Ⅱ型胶原,并对其生物活性和结构进行了研究,主要研究内容如下:采用高效液相色谱法建立了Ⅱ型胶原的测定方法。色谱条件为:流动相,A为5%乙腈、0.05%TFA,B为80%乙腈（v/v）;采用线形梯度洗脱;检测波长,220 nm;流速,1 mL/min。柱温,35℃,进样量,10μL。高效液相色谱法对Ⅱ型胶原进行定量检测与传统的WoessnerⅠ法具有良好的相关性（R2>0.99）。高效液相色谱法在保证准确性和重现性的基础上,具有省去繁琐耗时的样品预处理、所需样品用量少、易于自动化的优点,从而为Ⅱ型胶原提供了一种新的测定方法。确定了从鸡胸软骨中制备Ⅱ型胶原的工艺路线。首先采用甲醇:氯仿（2:1）低温浸泡除去脂肪,使脂肪的残留率降至0.072%;再用1 mol/L的NaCl溶液浸泡骨料并缓慢搅拌除去大部分盐溶性的杂蛋白;采用胃蛋白酶切除Ⅱ型胶原的端肽,使Ⅱ型胶原由不溶性转为可溶性,胃蛋白酶解温度、时间及胃蛋白酶浓度显著影响Ⅱ型胶原的提取率及二级结构。胃蛋白酶提取鸡胸软骨Ⅱ型胶原的最佳工艺条件为:胃蛋白酶浓度为1%（w/v）,酶解温度20℃,酶解时间36h,提取率为43.49%,Ⅱ型胶原保持着比较完整的三股螺旋结构。采用NaCl沉淀酶解液中的Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原最佳的盐析工艺条件为:氯化钠浓度为3 mol/L,盐析温度20℃,盐析时间为24h,回收率为85.93%。采用DEAE-sepharose CL 6B离子交换色谱分离Ⅱ型胶原与糖胺聚糖,由SDS - PAGE及RP-HPLC测定结果表明:鸡胸软骨Ⅱ型胶原样品与Sigma公司标准品及关节软骨Ⅱ型胶原样品的电泳谱带相同,具有较高的α带和少量的β二聚体。图谱上无其他杂带,经纯化后的Ⅱ型胶原的纯度较高。研究了Ⅱ型胶原的结构及理化性质。结果表明Ⅱ型胶原中甘氨酸、羟脯氨酸和丙氨酸含量最高,每1000个氨基酸残基中分别为310、117及115。组氨酸和酪氨酸含量较低,没有检测出色氨酸,为典型动物胶原的氨基酸组成。园二色性及红外测定结果表明Ⅱ型胶原是由三条相同的α链构成的螺旋。Ⅱ型胶原的变性温度为43.843℃,在220 nm附近产生最大的光吸收,在pH值为5.8时,溶解度达到最低。由AFM（原子力显微镜）测定结果表明,Ⅱ型胶原原纤维由一个个成念珠状的结构紧密连接而成,每个念珠即为一个横纹周期（D周期）,平均每个周期为65 nm,每个胶原分子的长度约为300 nm,直径约为1.5 nm。Ⅱ型胶原的周期结构对应明带和暗带构成的高低起伏的波状结构,明带对应波峰,暗带对应波谷,每个周期的波峰和波谷有5 nm左右的高度差。以EDC/NHS为交联剂制备Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架,并对Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架修复软骨损伤的功能进行研究。结果表明,EDC/NHS交联增加了胶原支架的热稳定性及对胶原酶的抗性,并降低了游离氨基酸的含量及含水率,从而改善了胶原分子作为细胞支架易降解的缺点。最适的EDC的添加浓度为7 mg/mL。Ⅱ型胶原与硫酸软骨素复合后,细胞亲和性大大提高,软骨细胞能很好的在复合支架上粘附、生长和增殖,并保持软骨细胞特异分化的表型,分泌Ⅱ型胶原与蛋白多糖。培养14天后已有软骨样组织形成,这表明Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架适合作为软骨组织工程研究的细胞载体材料。通过建立大鼠类风湿性关节炎模型,研究了Ⅱ型胶原对人类类风湿性关节炎的防治作用。采用Ⅱ型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎症状主要表现为关节软骨破坏,增生性滑膜炎,并伴有单个核细胞浸润并持续存在于滑膜中。从测得的与RA紧密联系的三种炎性细胞因子水平来看,口服Ⅱ型胶原和氨基葡萄糖显著抑制了RA的发展,提示其治疗作用机理可能与抑制滑膜细胞分泌炎性细胞因子,纠正Th1和Th2细胞平衡失调有关,也进一步表明了Ⅱ型胶原和硫酸氨基葡萄糖作为防治类风湿性关节炎保健品的可行性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章绪论
• 1.1 概述
• 1.2 胶原
• 1.2.1 胶原的概念
• 1.2.2 胶原的分布及分类
• 1.3 Ⅱ型胶原
• 1.3.1 Ⅱ型胶原的分布
• 1.3.2 软骨的基本组成
• 1.3.3 Ⅱ型胶原的结构
• 1.3.3.1 Ⅱ型胶原的一级结构
• 1.3.3.2 Ⅱ型胶原的二级结构
• 1.3.3.3 Ⅱ型胶原的三级结构
• 1.3.3.4 Ⅱ型胶原的四级结构
• 1.3.4 Ⅱ型胶原的定量
• 1.3.4.1 总蛋白质的测定
• 1.3.4.2 特异性氨基酸的测定
• 1.3.4.3 免疫学检测法
• 1.3.4.4 高效液相色谱法
• 1.4 胶原的提取
• 1.4.1 Ⅱ型胶原的提取原料
• 1.4.2 提取方法
• 1.4.2.1 酸法
• 1.4.2.2 碱法
• 1.4.2.3 酶法
• 1.4.2.4 中性盐法
• 1.4.3 盐析
• 1.5 Ⅱ型胶原的性质
• 1.6 Ⅱ型胶原的应用
• 1.6.1 胶原在食品领域中的应用
• 1.6.1.1 胶原在传统食品工业中的应用
• 1.6.1.2 胶原在保健品领域的应用
• 1.6.2 胶原在医学领域的应用
• 1.6.2.1 胶原在组织工程化软骨组织构建中的作用
• 1.6.2.2 胶原在其它医疗领域中的作用
• 1.6.3 胶原在美容业中的应用
• 1.7 国内外对Ⅱ型胶原制品的研究进展与存在问题
• 1.7.1 国外对Ⅱ型胶原制品的研究与开发现状
• 1.7.2 国内Ⅱ型胶原制品的研究与开发现状
• 1.7.3 存在问题
• 1.8 本课题的立题背景和意义
• 1.9 本课题的主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 Ⅱ型胶原测定方法的建立
• 2.1 前言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 实验设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 WOESSNER 法测定羟脯氨酸含量
• 2.3.1.1 胶原水解液的制备
• 2.3.1.2 试剂的配制
• 2.3.1.3 测定方法
• 2.3.1.4 结果计算
• 2.3.2 反相高效液相色谱法测定Ⅱ型胶原含量
• 2.3.2.1 样品前处理
• 2.3.2.2 色谱柱条件
• 2.3.2.3 标准曲线的制作及线性范围
• 2.3.2.4 回收率试验
• 2.3.2.5 精密度试验
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 羟脯氨酸测定标准曲线
• 2.4.2 高效液相色谱法测定Ⅱ型胶原的含量
• 2.4.2.1 检测波长的选择
• 2.4.2.2 不同乙腈浓度对Ⅱ型胶原测定结果的影响
• 2.4.2.3 Ⅱ型胶原标准曲线的绘制
• 2.4.2.4 高效液相色谱法精密度试验
• 2.4.2.5 高效液相色谱法回收率试验
• 2.4.3 RP-HPLC 法与WOESSNER 法的相关性
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 Ⅱ型胶原提取工艺的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和仪器
• 3.2.1 实验材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 常规成分分析
• 3.3.2 Ⅱ型胶原粗制品提取工艺流程
• 3.3.3 原料预处理
• 3.3.4 软骨超微结构的测定
• 3.3.5 软骨脱脂
• 3.3.6 软骨中杂蛋白的去除
• 3.3.7 胃蛋白酶酶解工艺
• 3.3.8 盐析
• 3.3.9 脱盐
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 原料预处理及基本组成
• 3.5.2 鸡胸软骨的超微结构
• 3.5.3 软骨脱脂
• 3.5.4 脱脂软骨中杂蛋白的去除
• 3.5.5 酶法提取Ⅱ型胶原的最佳工艺条件
• 3.5.5.1 酶解温度对Ⅱ型胶原提取率及二级结构的影响
• 3.5.5.2 酶解时间对Ⅱ型胶原提取率及二级结构的影响
• 3.5.5.3 胃蛋白酶浓度对提取率及二级结构的影响
• 3.5.5.4 最佳酶解条件的确定
• 3.5.6 盐析的最佳工艺条件
• 3.5.6.1 温度对胶原回收率的影响
• 3.5.6.2 盐析时间对胶原回收率的影响
• 3.5.6.3 NaCl 浓度对胶原回收率的影响
• 3.5.6.4 盐析工艺的响应面分析
• 3.5.7 Ⅱ型胶原的超滤脱盐
• 3.5.8 Ⅱ型胶原粗制品的组成
• 3.6 本章小节
• 参考文献
• 第四章 Ⅱ型胶原的纯化及结构研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和设备
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 Ⅱ型胶原的纯化
• 4.3.2 Ⅱ型胶原的离子交换色谱柱纯化
• 4.3.3 Ⅱ型胶原纯度的鉴定
• 4.3.3.1 SDS-PAGE 电泳
• 4.3.3.2 RP-HPLC 色谱
• 4.3.4 Ⅱ型胶原的结构
• 4.3.5 Ⅱ型胶原的理化性质测定
• 4.3.5.1 变性温度的测定
• 4.3.5.2 紫外分光光度计测定
• 4.3.5.3 Ⅱ型胶原溶解度的测定
• 4.4 结果和讨论
• 4.4.1 Ⅱ型胶原的纯化
• 4.4.2 Ⅱ型胶原的表面结构
• 4.4.3 Ⅱ型胶原的纯度
• 4.4.4 Ⅱ型胶原的组成和结构
• 4.4.4.1 Ⅱ型胶原的氨基酸组成
• 4.4.4.2 Ⅱ型胶原的红外光谱
• 4.4.4.3 Ⅱ型胶原的二级结构
• 4.4.4.4 Ⅱ型胶原的晶体结构
• 4.4.4.5 Ⅱ型胶原的超微结构
• 4.4.4.6 Ⅱ型胶原的微观结构
• 4.4.5 Ⅱ型胶原的理化性质
• 4.4.5.1 Ⅱ型胶原的变性温度
• 4.4.5.2 Ⅱ型胶原的紫外吸收光谱
• 4.4.5.3 Ⅱ型胶原的溶解性
• 4.5 本章小节
• 参考文献
• 第五章 Ⅱ型胶原修复软骨损伤的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与设备
• 5.2.1 实验材料与主要试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 Ⅱ型胶原-硫酸软骨素复合支架的制备
• 5.3.2 Ⅱ型胶原支架性质的测定
• 5.3.2.1 变性温度的测定
• 5.3.2.2 游离氨基含量的测定
• 5.3.2.3 硫酸软骨素的交联量
• 5.3.2.4 Ⅱ型胶原酶对支架的降解
• 5.3.2.5 Ⅱ型胶原支架的超微结构
• 5.3.3 软骨细胞的分离培养
• 5.3.3.1 兔关节软骨细胞的分离培养
• 5.3.3.2 兔关节软骨细胞的鉴定
• 5.3.3.3 支架处理
• 5.3.3.4 细胞接种和分组
• 5.3.4 细胞培养指标的测定
• 5.3.4.1 DNA 及GAG 的测定
• 5.3.4.2 Ⅱ型胶原的测定
• 5.3.4.3 组织形态学切片的制备
• 5.3.4.4 扫描电镜观察软骨细胞形态
• 5.4 结果和讨论
• 5.4.1 EDC 对Ⅱ型胶原支架的性质的影响
• 5.4.1.1 EDC 浓度对Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架热稳定性的影响
• 5.4.1.2 EDC 浓度对Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架游离氨基含量的影响
• 5.4.1.3 EDC浓度对Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架硫酸软骨素含量的影响
• 5.4.1.4 EDC 浓度对Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架胶原酶抗性的影响
• 5.4.1.5 EDC 浓度对Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架吸水率的影响
• 5.4.1.6 Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架的表面结构
• 5.4.1.7 Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架的超微结构
• 5.4.2 软骨细胞的鉴定
• 5.4.2.1 倒置显微镜观察
• 5.4.2.2 软骨细胞表型鉴定
• 5.4.3 软骨细胞在支架上的培养
• 5.4.3.1 胶原支架对软骨细胞吸附力的观察
• 5.4.3.2 不同支架材料对DNA 和糖胺聚糖（GAG）含量的影响
• 5.4.3.3 不同支架材料的组织切片观察
• 5.4.3.4 不同支架材料对软骨细胞Ⅱ型胶原分泌的影响
• 5.4.3.5 不同支架上软骨细胞的超微结构
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 Ⅱ型胶原对类风湿性关节炎的作用
• 6.1 前言
• 6.2 材料和仪器
• 6.2.1 实验材料与主要试剂
• 6.2.2 主要仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 主要试剂的配制
• 6.3.1.1 PBS 的配制
• 6.3.1.2 青、链霉素溶液的配制
• 6.3.1.3 培养液的配制
• 6.3.1.4 血清的灭活
• 6.3.1.5 谷氨酰胺溶液
• 6.3.1.6 红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）
• 6.3.2 实验动物及分组
• 6.3.3 CIA 模型的建立及分组
• 6.3.4 关节炎的判断及观察方法
• 6.3.4.1 踝关节及脚掌厚度测量
• 6.3.4.2 关节炎指数
• 6.3.4.3 组织切片
• 6.3.5 淋巴细胞增殖反应
• 6.3.6 DTH 反应（急性超敏反应）
• 6.3.7 细胞因子的测定
• 6.3.7.1 白细胞介素I（IL-1）的诱生与检测
• 6.3.7.2 白细胞介素Ⅱ（IL-2）的诱生与检测
• 6.3.7.3 TNF-α的测定
• 6.3.8 统计学处理
• 6.4 结果和讨论
• 6.4.1 大鼠类风湿性关节炎模型的建立
• 6.4.2 Ⅱ型胶原对大鼠足掌厚度的影响
• 6.4.3 Ⅱ型胶原对大鼠踝关节的影响
• 6.4.4 Ⅱ型胶原对大鼠关节评分的影响
• 6.4.5 Ⅱ型胶原对大鼠急性超敏反应的影响
• 6.4.6 Ⅱ型胶原对大鼠淋巴细胞增殖的影响
• 6.4.7 细胞因子
• 6.4.7.1 Ⅱ型胶原对大鼠IL-1 分泌的影响
• 6.4.7.2 Ⅱ型胶原对大鼠IL-2 分泌的影响
• 6.4.7.3 Ⅱ型胶原对大鼠TNF-α分泌的影响
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 本论文主要创新点
• 攻读博士期间发表与本论文相关的文章
• 致谢