旋毛虫COXⅠ基因多态性分析和成囊前期幼虫检疫方法的研究

论文摘要

旋毛虫病是一种严重的食源性人兽共患寄生虫病,主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的肉及肉制品所致。由于旋毛虫属内不同虫种的地理分布、宿主范围、致病性以及宿主对不同虫种的免疫应答等方面存在有明显差异,因此,旋毛虫属分类的研究对旋毛虫病的病原学、免疫学、流行病学、临床及预防控制等均具有重要意义。旋毛虫不仅严重危害人类健康,也给养猪业和食品工业造成重大的经济损失。在欧共体,法律规定在其15个成员国内饲养的生猪必须进行旋毛虫检疫,其费用约为5.7亿美元;在我国,旋毛虫是强制性肉类检疫项目,每年用于猪肉旋毛虫检疫的费用达18亿元。为了对我国旋毛虫不同地理株进行分子鉴定和多态性分析,本文应用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RLFP）和PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术,对我国7个旋毛虫地理株的细胞色素氧化酶Ⅰ（COXⅠ）基因片段进行分析。本文还对旋毛虫肌幼虫在不同宿主肌肉中的分布、囊包内幼虫含量以及目前国内外普遍应用的肉类及肉制品中旋毛虫（尤其成囊前期幼虫）检疫方法的敏感性及其影响因素进行了观察。材料与方法1.旋毛虫与实验动物本实验所用虫种为旋毛虫（T1）、乡土旋毛虫（T2）、布氏旋毛虫（T3）、伪旋毛虫（T4）及纳氏旋毛虫（T7）;7个猪源旋毛虫地理株来自河南、湖北、云南、西安、哈尔滨、同江及天津。健康雄性昆明小鼠和Sprague Dawley（SD）大鼠购自河南省实验动物中心。2.旋毛虫肌幼虫基因组DNA的提取及PCR扩增酚氯仿法提取旋毛虫肌幼虫基因组DNA,使用旋毛虫COXⅠ基因的简并引物:L6625（5’-TTYTGRTTYTTYGGNCAYCC-3’）:H7005（5’-ACNACRTARTANGTRTCRTG-3’）。对所提取的旋毛虫肌幼虫基因组DNA进行PCR扩增。3.PCR-RFLP使用Trull（MseI）限制性内切酶对纯化后的PCR产物进行酶切,3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,用凝胶图像分析仪观察并分析酶切结果。4.PCR-SSCP将纯化后的PCR产物进行SSCP,8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSCP结果,电泳后银染显色。通过计算获得等位基因频率、基因型频率以及多态性信息含量。5.旋毛虫幼虫在大鼠与小鼠肌肉分布及囊包内幼虫数量的观察将30只昆明小鼠和30只SD大鼠均随机分为轻、中、重度感染组,每组10只,分别按每g体重1、5、20条肌幼虫经口感染。感染后40d剖杀,取不同部位肌肉称重后压片镜检,观察不同部位每g肌肉虫荷（larvae per gram,lpg）及囊包内幼虫数量。6.ICT-消化法对肉中旋毛虫肌幼虫检测的敏感性观察按每g肌肉1～5条幼虫加入正常猪肉样本中,人工消化后镜检,观察不同虫荷的检出率。7.成囊前期幼虫（PEL）的检疫3组小鼠分别用20、10及5条幼虫感染,感染后18d剖杀,应用国际旋毛虫病委员会推荐的消化法（ICT-消化法）、我国国家标准-猪旋毛虫病诊断技术GB/T 18642-2002（国标消化法）和贝氏法,对感染后18d的成囊前期幼虫进行检验,比较3种方法的检疫效果。结果1.旋毛虫不同种和地理株COXⅠ基因的PCR扩增结果对5个旋毛虫国际参考株和我国7个旋毛虫地理株COXⅠ基因片段扩增后电泳结果表明,上述5种旋毛虫和7个地理株的扩增片段大小一致（约为419bp）。2.PCR-RFLP检测结果对5种旋毛虫和7个地理株COXⅠ基因扩增产物经限制性内切酶Trull（MseI）酶切后发现T2、T3、T4、T7和天津株均具有独特的酶切带型:T2（22bp,70bp,327bp）,T3（92bp,327bp）,T4（419bp）,T7（62bp,64bp,70bp,223bp）,天津株（92bp,126bp,201bp）;其他6个地理株的酶切带型和T1一致（22bp,70bp,126bp,201bp）。3.PCR-SSCP分析结果对我国7个旋毛虫地理株与波兰株COXⅠ基因扩增片段进行SSCP检测,发现有3种基因型（AA、AB和BB）:波兰株为AA型;哈尔滨、黑龙江同江、西安、云南、湖北及河南株均为AB型;天津株为BB型。以AB基因型频率最高（0.75）,AA与BB基因型均为0.125:A和B等位基因频率相等,均为0.5;旋毛虫不同地理株COXⅠ基因的多态性信息含量（PIC）为0.375,为中度多态性。4.旋毛虫幼虫在大鼠与小鼠肌肉分布及囊包内幼虫数量大鼠在轻度感染时以咬肌虫荷最高,中、重度感染时分别以膈肌和舌肌虫荷最高;小鼠在轻度感染时以咬肌虫荷最高,中、重度感染时均以膈肌虫荷最高。在大鼠肌肉内8028个囊包中,含1、2、3条幼虫的囊包分别占97.91%、1.95%及0.14%;在小鼠肌肉内7559个囊包中,含1、2、3条幼虫的囊包分别占97.33%、2.54%及0.13%。小鼠肌肉内多幼虫（2～3条）囊包的检出率明显高于大鼠（χ2=5.644,P＜0.05）。多幼虫囊包的检出率在大鼠和小鼠均随感染剂量的增加而升高(χ大鼠2=42.656,P＜0.05;χ小鼠2=45.713,P＜0.05);在含3条幼虫囊包的肌肉内,重度感染的大鼠和小鼠肌肉分别占81.82%（9/11）与100%（10/10）。未发现含有4条及4条以上幼虫的囊包。5.ICT-消化法对肉中旋毛虫肌幼虫检测的敏感性观察每g含5、4及3条幼虫的各10份猪肉,ICT-消化法的检出率均为100%;每g含2、1条幼虫的各10份猪肉,检出率仅分别为30%和10%。6.三种方法对成囊前期幼虫检验结果的比较旋毛虫幼虫感染小鼠后18d,每只感染20条幼虫的15份小鼠肌肉,ICT-消化法、国标消化法与贝氏法的幼虫检出率均为100%(χ202=0.000,P＞0.05);每只感染10条幼虫的15份小鼠肌肉,3种方法的检出率分别为93.33%,93.33%及100%(χ102=1.645,P＞0.05);每只感染5条幼虫的30份小鼠肌肉,3种方法的检出率分别为63.33%,90%及100%（χ52=18.866,P＜0.05）。结论1.我国7个旋毛虫地理株及波兰株的COXⅠ基因片段的遗传变异度为中度多态性;我国旋毛虫地理株中,河南、湖北、云南、西安、哈尔滨及同江株可归为一类,天津株可归为另一类。2.对鼠类进行旋毛虫感染的病原学检查时应首选咬肌,其次为膈肌或舌肌;进行肌肉活检或肉类检疫时发现含3条幼虫的囊包提示为重度感染。3.在旋毛虫轻度感染时,ICT-消化法有较高的漏检率;对成囊前期幼虫的检疫,贝氏法明显优于ICT-消化法和国标消化法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 旋毛虫COXI基因多态性分析
• 1 前言
• 1.1 旋毛虫病的危害
• 1.2 旋毛虫属生物学分类现状
• 1.3 研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 生化试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 溶液的配置
• 2.4 实验动物
• 2.5 旋毛虫虫株
• 2.6 实验动物的感染
• 2.7 旋毛虫肌幼虫的收集
• 2.8 旋毛虫肌幼虫总DNA的提取及检测
• 2.9 PCR反应及PCR产物鉴定
• 2.10 胶回收试剂盒回收PCR产物
• 2.11 PCR产物RFLP分析
• 2.12 PCR产物SSCP分析
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增产物电泳
• 3.2 PCR产物的RFLP分析结果
• 3.3 PCR产物的SSCP分析
• 4 讨论
• 4.1 目的基因的获得
• 4.2 PCR扩增
• 4.3 关于COXI
• 4.4 旋毛虫COXI基因PCR-RFLP分析
• 4.5 旋毛虫COXI基因PCR-SSCP分析
• 5 结论
• 参考文献
• 第二部分 成囊前期幼虫检疫方法的研究
• 1 前言
• 1.1 旋毛虫肌幼虫囊包
• 1.2 旋毛虫病的流行及检疫现状
• 1.3 研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验中所用试剂及溶液配制方法
• 2.2 用到的主要仪器
• 2.3 实验动物
• 2.4 旋毛虫虫株
• 2.5 实验动物的感染
• 2.6 人工消化法
• 2.7 贝氏法用于成囊前期幼虫（Pre-encapsulated larva,PEL）的收集
• 2.8 旋毛虫幼虫在大鼠与小鼠肌肉分布及囊包内幼虫数量的观察
• 2.9 ICT消化法对肉中旋毛虫肌幼虫检测的敏感性观察
• 2.10 消化法用于PEL检疫的影响因素观察
• 2.11 三种方法对轻度感染时成囊前期幼虫检测效果的比较
• 2.12 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 旋毛虫幼虫在大鼠与小鼠肌肉分布及囊包内幼虫数量的观察
• 3.2 肉中旋毛虫最低虫荷的检疫结果
• 3.3 PEL检疫方法的影响因素及其检测效果的比较
• 4 讨论
• 4.1 旋毛虫幼虫在大鼠与小鼠肌肉分布及囊包内幼虫数量
• 4.2 成囊前期幼虫的检疫
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 英文缩略词
• 后记