论文题目: 枯草芽孢杆菌B53的分离鉴定及产聚γ-谷氨酸的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 食品科学
作者: 惠明
导师: 牛天贵
关键词: 聚谷氨酸,枯草芽孢杆菌,分离鉴定,细胞融合,纯化,生物絮凝剂
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 聚γ-谷氨酸（γ-PGA）主要是由一些芽孢杆菌产生的一种水溶性的胞外氨基酸聚合物。近年来被作为高吸水性材料、增稠剂、药物载体、生物絮凝剂及重金属吸附剂等广泛地应用于农业、食品、医药、化妆品及水处理等领域中,是一种具有极大开发价值和广阔应用前景的新型多功能高分子材料。本文从γ-PGA产生菌的筛选及鉴定、发酵条件优化及合成机制、菌种选育、γ-PGA的提纯及理化因素对其分子结构的影响、γ-PGA的应用等方面进行了研究。主要研究结果如下: （1）从76个样品分离得到的231株产芽孢细菌中筛选出一株聚γ-谷氨酸生产菌芽孢杆菌B53,其所产聚合物最大吸收波长为212nm,分子量集中在570～669kD之间,呈多分子量聚集体存在;从细胞形态、生理生化及遗传特征上分析鉴定B53菌株为枯草芽孢杆菌。 （2）B.subtilis B53合成γ-PGA的适宜碳氮源是甘油、柠檬酸、谷氨酸及硫酸铵,K2HPO4及Ca2+、Fe3+对γ-PGA的合成有显著的促进作用。通过正交试验和回归分析得出B53菌株合成γ-PGA的适宜培养基组成（g/L）:L-Glu 20,CTA 9.86,Glycerol 80.36,（NH4）2SO47,MgSO4·7H2O0.5,FeCl3·6H2O0.02,K2HPO40.89,CaCl20.03,MnSO4·H2O 0.3。种子液培养24h,接种量4%（V/V）,装液量50mL/300mL三角瓶,初始pH6.5,在37℃,150r/min摇床培养84h,γ-PGA的产量达到26.67g/L。5L发酵罐分批发酵试验表明:在发酵过程中菌体形态与聚合物结构有明显的变化:同柠檬酸和谷氨酸的消耗相比,甘油的代谢比较快,在甘油消耗比较快的阶段伴随γ-PGA的快速合成;γ-PGA的分子量在发酵54h以前基本没有变化,但之后分子量范围逐步变宽;分批发酵产量达18.61g/L。补料发酵试验发现,在发酵中期添加适量甘油及在发酵培养基中添加20～100U/mL的青霉素或10μg/L的生物素都可有利于γ-PGA产量的提高,而添加表面活性剂（如Tween 20、SDS）则不利于γ-PGA的合成。 （3）通过细胞融合技术选育出枯草芽孢杆菌B53与谷氨酸棒杆菌B9的稳定融合株R162,该菌株在以葡萄糖和硫酸铵为碳氮源的培养基上γ-PGA的产量比B53提高一倍以上（有多糖合成）。通过60Co γ射线辐照选育出γ-PGA高产突变株F2-28,其发酵产量比B53提高了82.31%。 （4）当发酵液中γ-PGA含量人于20g/L,离心除菌后添加发酵液体积2.5倍的95%乙醇可以得到较好的提取效果;对γ-PGA发酵液采用超滤浓缩可以节约乙醇的用量,离心除菌及超滤浓缩要消耗大量能量。酸化或加热处理可明显降低发酵液的黏度,从而降低离心或超滤操作能耗,但酸化或热处理会使γ-PGA的分子结构发生变化,分子量降低。γ-PGA在pH值中性下比较稳定,pH<5或pH>8,容易发生降解,这是pH值改变引起发酵液黏度降低的主要原因。 （5）采用超声波、紫外线及60Co γ射线辐照处理可以对γ-PGA进行分子修饰,对低分子量聚γ-谷氨酸的生产具有参考作用。Ca2+、Cu2+与Zn2+等金属离子可与γ-PGA发生络合作用。 （6）γ-PGA对高岭土、Ca（OH）2、Mg（OH）2表现出较强的絮凝活性,采用0.6g/L的γ-PGA溶液对高岭土的絮凝活性可达到90%以上。K+、Fe2+、Mg2+及Ca2+具有明显的促絮凝作用,而Al3+、Fe3+则起削弱作用。CaCl2浓度超过2g/L及介质溶液维持pH值中性都有利于γ-PGA提高絮凝活性。另外,γ-PGA可制备成水凝胶用作涂膜材料,对水果蔬菜的保鲜有一定作用。
论文目录:
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 聚γ-谷氨酸研究进展
1.2.1 聚γ-谷氨酸的理化性质
1.2.2 聚谷氨酸的生产方法
1.2.3 聚γ-谷氨酸的生产菌及其合成途径
1.2.4 聚γ-谷氨酸生物合成的关键酶类及合成机制
1.2.5 聚γ-谷氨酸合成的生理学机制
1.2.6 聚γ-谷氨酸生物合成的分子遗传学——相关基因及其调控
1.2.7 聚γ-谷氨酸的发酵技术
1.2.8 聚γ-谷氨酸的提取纯化及定量分析
1.2.9 聚γ-谷氨酸的化学修饰
1.2.10 聚γ-谷氨酸的应用领域
1.2.11 生产企业
1.2.12 展望与前景
1.2.13 γ-PGA相关的专利及分析
1.3 本课题的研究内容及目标
第二章 聚γ-谷氨酸产生菌的分离与鉴定
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料
2.2.2 方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 γ-PGA产生菌的筛选
2.3.2 聚γ-谷氨酸产生菌B53的鉴定
2.4 小结
第三章 枯草芽孢杆菌B53产γ-PGA发酵条件及合成机制
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 不同碳源对B53菌株发酵产γ-PGA的影响
3.3.2 不同氮源对B53菌株发酵产γ-PGA的影响
3.3.3 前体物质对B53菌株合成γ-PGA的影响
3.3.4 pH值对B53菌株发酵产γ-PGA的影响
3.3.5 装液量及发酵温度对B53菌株发酵产γ-PGA的影响
3.3.6 不同接种量对B53菌株合成γ-PGA的影响
3.3.7 B53菌株合成γ-PGA培养基的优化——正交试验设计
3.3.8 B53菌株合成γ-PGA培养基的优化——回归试验设计
3.3.9 优化培养基的验证
3.3.10 5L发酵罐分批发酵生产γ-PGA的过程特征
3.3.11 补料发酵生产γ-PGA的初步探讨
3.3.12 γ-PGA的合成机制研究
3.4 小结
第四章 聚γ-谷氨酸产生菌的育种研究
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.2 方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 原生质体融合育种
4.3.2 枯草芽孢杆菌B53的辐照育种
4.4 小结
第五章 聚γ-谷氨酸的提取及理化因素对其分子结构的影响
5.1 前言
5.2 材料和方法
5.2.1 材料
5.2.2 方法
5.3 结果与讨论
5.3.1 聚谷氨酸提取时乙醇的添加量对γ-PGA回收效果的影响
5.3.2 温度和pH值对发酵液黏度及聚合物性质的影响
5.3.3 超声波处理对γ-PGA分子结构的影响
5.3.4 物理射线照射对γ-PGA分子结构的影响
5.3.5 金属离子对γ-PGA分子结构的影响
5.3.6 γ-PGA的冷冻干燥
5.3.6 有机溶剂沉淀法提取γ-PGA的机制分析
5.4 小结
第六章 聚γ-谷氨酸及其产生菌的初步应用
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 材料
6.2.2 方法
6.3 结果与讨论
6.3.1 聚γ-谷氨酸(γ-PGA)用作生物絮凝剂
6.3.2 γ-PGA用作保水材料
6.3.3 枯草芽孢杆菌B53用于生产纳豆激酶
6.3.4 枯草芽孢杆菌B53用于生物防治
6.4 小结
第七章 全文总结及展望
7.1 全文试验总结
7.2 论文的创新点
7.3 展望
参考文献
致谢
附录
作者简历
发布时间: 2005-07-18
参考文献
- [1].微生物制备γ-聚谷氨酸的研究[D]. 石峰.浙江大学2006
- [2].利用代谢酶学和模型技术改善谷氨酸发酵的稳定性和糖酸转化率[D]. 曹艳.江南大学2013
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